Диагностика инфекционных заболеваний урогенитального тракта методом ПЦР в режиме реального времени.

4817
Диагностика инфекционных заболеваний урогенитального тракта методом  ПЦР в режиме реального времени.

В настоящее время инфекционно-воспалительные заболевания урогенитального тракта у женщин занимают в структуре акушерско-гинекологической заболеваемости первое место в мире. Их частота в различных популяциях колеблется от 30 до 80%.

Заболевания, вызванные условно-патогенной микрофлорой, могут протекать как с клинически выраженной симптоматикой, так и бессимптомно. Бессимптомное течение заболевания в ряде случаев приводит к развитию серьезных осложнений. Установлено, что урогенитальные заболевания, вызванные условно-патогенными микроорганизмами, являются причиной увеличения риска заболевания инфекциями, передающимися половым путем (сифилис, трихомониаз, гонорея, хламидиоз), и ВИЧ.

Несвоевременная диагностика инфекционных заболеваний, вызванных условно-патогенной микрофлорой, может стать причиной:

– нарушения репродуктивной функции;

– спонтанных абортов, преждевременных родов;

– внутриутробного инфицирования и задержки внутриутробного развития плода;

– осложнений после хирургических вмешательств на органах малого таза и постнатальных осложнений матери и ребенка.

Учитывая важность и актуальность решения проблемы объективной лабораторной диагностики урогенитальных инфекционно-воспалительных заболеваний, вызванных условно-патогенной микрофлорой, для репродуктивного здоровья женщин, возникла потребность в разработке и внедрении в практическое здравоохранение новых диагностических подходов, позволяющих своевременно (до развития осложнений) диагностировать такие заболевания. Также необходимо определение объема медикаментозной терапии и осуществление контроля эффективности лечения.

Результаты клинической диагностики дают возможность только лишь предположить наличие заболевания, т. к. инфекции, передающиеся половым путем (трихомониаз, гонорея, сифилис и хламидиоз) и вызванные условно-патогенной микрофлорой, в подавляющем большинстве случаев не имеют специфических клинических симптомов. Наиболее частым заболеванием, ассоциированным с нарушением микрофлоры урогенитального тракта, является бактериальный вагиноз (БВ). БВ встречается у 24% женщин в структуре общей гинекологической заболеваемости и у 87,7% больных, обращающихся по поводу обильных длительных выделений.

Под БВ понимают полимикробный клинический синдром, характеризующийся специфическими аномалиями вагинальных выделений и нарушением вагинальной микрофлоры, при котором нормальная флора замещается факультативными и строго анаэробными микроорганизмами. При этом наблюдается пролиферация условно-патогенной флоры.

Для упрощения диагностики БВ и повышения ее достоверности разработано несколько критериев.

Критерии Амсела – наиболее быстрый и распространенный способ диагностики БВ (R. Amsel at al., 1983). Наличие трех из четырех признаков: рН отделяемого влагалища более 4,5; белые гомогенные выделения, покрывающие слизистую влагалища; положительный аминный тест с КОН и наличие ”ключевых клеток“. Существующие бессимптомные формы БВ (50% случаев), а также недостаточно высокая чувствительность критериев Амсела привели к поиску более чувствительных методов.

Широкое распространение получила балловая диагностическая система Ньюджента (Nugent criteria) (Nugent RP, Krohn MA, Hillier SL, 1991). Эта система основана на подсчете бактерий в мазке, окрашенном по Граму, определенной морфологии и характере окрашивания, соответствующих лактобактериям, гарднереллам, бактероидам и мобилункусу. При наборе от 7 до 10 баллов ставится диагноз “бактериальный вагиноз”. Система Ньюджента применяется на Западе наравне с критериями Амсела, тем не менее в одном многоцентровом исследовании было показано, что в 11–30% случаев диагнозы, поставленные с помощью этих методов, не совпадают. Это может быть связано с тем, что при микроскопии можно выявить только те микроорганизмы, которые обладают размерами, достаточными для визуализации. Многие виды и роды условно-патогенных микроорганизмов морфологически похожи, тогда как их патогенные свойства и чувствительность к антибиотикам могут значительно отличаться. Некоторые бактерии, например Atopobium vaginae, Mycoplasma hominis и т. д., о которых известно, что они ассоциированы с развитием БВ, не визуализируются при микроскопии.

Недостатком микроскопического исследования мазков, окрашенных по Граму, является качественная оценка, ограниченная определением морфологии без возможности видовой характеристики микроорганизмов и приблизительная количественная оценка состава микроорганизмов. Микроскопия не позволяет идентифицировать ряд этиологически значимых для развития патологических процессов условно-патогенных возбудителей. Имеют место субъективизм и зависимость результата исследования от профессиональной квалификации специалиста лаборатории.

Более информативным является способ диагностики урогенитальных заболеваний, вызванных условно-патогенной микрофлорой, путем микробиологического (культурального) исследования (Приказ Минздрава СССР от 22.04.1985 № 535 “Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений)”. Этот способ позволяет установить видовой состав аэробных, факультативно-анаэробных и некоторых облигатно-анаэробных бактерий и тем самым подтвердить вид микроорганизмов, обнаруженных при микроскопии мазков, окрашенных по Граму.

Количественная оценка роста микроорганизмов на питательных средах характеризует их значимость у конкретного пациента. Так, например, установлены критерии нормальной микрофлоры урогенитального тракта у женщин при использовании культуральной диагностики:

– общая микробная обсемененность не превышает 106–108 КОЕ/мл;

– абсолютно преобладают лактобациллы;

– условно-патогенные микроорганизмы определяются в низком титре (104 КОЕ/мл) или отсутствуют.

До настоящего времени культуральный метод остается ”золотым стандартом“ этиологической лабораторной диагностики любого инфекционного процесса, в т. ч. вызванного условно-патогенной микрофлорой.

Однако и культуральный способ диагностики не лишен ряда серьезных недостатков. Условно-патогенная микрофлора, являющаяся наиболее частой причиной урогенитальных заболеваний у женщин, представлена, главным образом, анаэробными микроорганизмами. Для обеспечения анаэробных условий культивирования таких микроорганизмов требуется микробиологическая лаборатория с соответствующим оснащением и персоналом. Подавляющее большинство лечебных учреждений практического здравоохранения в настоящее время не имеют подобных условий.

Кроме того, в последние годы молекулярно-биологическими методами был обнаружен целый ряд новых условно-патогенных микроорганизмов (Atopobium vaginae, Mycoplasma genitalium и др.), которые либо не поддаются культивированию, либо являются трудно культивируемыми стандартной техникой (Ferris MJ, Masztal A, Aldridge KE. et al., 2004).

Существенными недостатками культурального метода также являются длительные сроки (в среднем 5 дней) и необходимость сохранения высокой жизнеспособности микроорганизмов до момента поступления биоматериала в лабораторию, что накладывает дополнительные ограничения на его хранение и транспортировку. В случае использования сухого тампона для взятия биоматериала, срок транспортировки образца в лабораторию ограничен часами. При использовании транспортных сред продолжается размножение микроорганизмов до поступления в лабораторию и возможно изменение их количественного соотношения. Культуральный метод не дает точной количественной оценки и используется только для ориентировочной оценки соотношения микроорганизмов между собой (Приказ МЗ СССР № 535 от 22.04.1985).

Объективные и субъективные ограничения методов лабораторной диагностики, применяемые сегодня в мировой медицинской практике, приводят к большому количеству диагностических ошибок: при манифестированном БВ – более чем в 60%, при кандидозном вульвовагините – до 77%; при микст-инфекции – до 87% (Schwiertz A. et al. 2006). Все это побуждает к поиску новых подходов к оценке микрофлоры урогенитального тракта.

Достижения молекулярной биологии, связанные с разработкой метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), предоставили новые возможности в изучении микробного состава у человека. В последние годы ПЦР широко используется для качественной идентификации инфекций, передающихся половым путем, таких как трихомониаз, гонорея, ВИЧ-инфекция и т. д. Также этот метод применяют и для идентификации условно-патогенной микрофлоры урогенитального тракта – Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum, Ureaplasma parvum и тд.

В норме микрофлора урогенитального тракта характеризуется большим количеством разнообразных микроорганизмов. К патогенным микроорганизмам, при выявлении которых обязательно назначается этиотропная терапия, относят: Treponema pallidum, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus ducrei, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Trichomonas vaginalis. Существует большая группа условно патогенных микроорганизмов, которые могут вызывать заболевание при определенных условиях – это микоплазмы (Mycoplasma hominis, Mycoplasma fermentans), уреаплазмы (Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum), энтерококки, энтеробактерии, стафилококки, стрептококки, гарднереллы (Gardnerella vaginalis), дрожжеподобные грибы (Candida spp.).

Патологические процессы характеризуются нарушением количественных соотношений нормо- и условно-патогенной микрофлоры при большом видовом разнообразии последней, поэтому количественное определение микроорганизмов имеет высокое значение.

Компания ”НПО ДНК-Технология“ предлагает новый подход к исследованию условно-патогенной флоры, основанный на комплексной оценке основных групп микроорганизмов, формирующих урогенитальную микрофлору, методом ПЦР в режиме реального времени. Предлагаемый подход дает возможность определить количество и соотношение условно-патогенной и нормальной флоры, что позволяет в случае необходимости выбрать правильную терапию и контролировать эффективность ее проведения.

Для этого разработаны и предлагаются клинико-диагностическим лабораториям наборы реагентов для исследования микрофлоры урогенитального тракта у женщин методом ПЦР в режиме реального времени Фемофлор 16, Фемофлор 8 и Фемофлор 4 (см. таблицу).  

Состав комплектов реагентов Фемофлор

Диагностика инфекционных заболеваний урогенитального тракта методом  ПЦР в режиме реального времени.  

Из одной биопробы методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени выполняется количественная оценка общей бактериальной массы, урогенитальной микрофлоры (лактобациллы) и комплекса аэробных и анаэробных микроорганизмов, микоплазм, грибов рода Candida, участвующих в развитии патологических процессов:

– сравнение количества лактобацилл с общей бактериальной массой позволяет исследовать состояние нормальной микрофлоры;

– сравнение количества представителей условно-патогенной микрофлоры с количеством лактобацилл позволяет предположить значение тех или иных микроорганизмов в развитии дисбактериоза и степень его выраженности;

– количественное определение ДНК эпителиальных клеток человека, попадающих в биопробу при правильном взятии материала, обеспечивает контроль качества преаналитического этапа, исключает получение ложноотрицательных результатов исследования;

– использование предлагаемого способа диагностики дает возможность выбора этиологического лечения;

– впервые можно оценить эффективности лечения;

– программное обеспечение, разработанное для амплификатора ДТ-96, позволяет настроить параметры анализа результатов согласно критериям, принятым в каждой конкретной лаборатории.

Для получения корректных результатов большое значение имеет качество взятия образца биоматериала для исследования, его хранение, транспортировка и предварительная обработка. Для этого в системе предусмотрена возможность анализа контроля взятия материала.

Диагностика инфекционных заболеваний урогенитального тракта методом  ПЦР в режиме реального времени.   

Определение структуры дисбаланса необходимо для решения вопросов, связанных с терапией.

Предлагаемый подход к исследованию состояния урогенитальной микрофлоры у женщин показан для:

– оценки качественного и количественного состава микроорганизмов урогенитального тракта;

– определения этиологической причины инфекционного процесса, что делает возможным осуществление направленной терапии;

– определения степени выраженности нарушений, в результате чего возможен индивидуальный подбор терапии;

– осуществления мониторинга эффективности проводимой терапии и оценки результатов лечения;

– восстановления нормальной микрофлоры;

– контроля проведения гормонозаместительной терапии при менопаузе.

Таким образом, впервые предложено объективное исследование, позволяющее наиболее полно и точно охарактеризовать качественный и количественный состав микрофлоры урогенитального тракта у женщин. В рамках данного исследования возможно выявление 23 групп микроорганизмов (факультативных и облигатных анаэробов, микроаэрофилов, микоплазм и грибов). Для проведения этого анализа разработано русскоязычное программное обеспечение для детектирующего амплификатора ДТ-96, позволяющее автоматически анализировать полученные данные и выдавать заключение в удобном для интерпретации виде. Данный метод пригоден как для повседневной лабораторной диагностики, так и в качестве чувствительного и высокоспецифичного инструмента для научных исследований.

В дополнение к настоящему методу, который позволяет определить этиологическую причину инфекционного процесса, вызванного условно-патогенной микрофлорой, рекомендуется:

– использование метода световой микроскопии для лабораторного подтверждения местной воспалительной реакции;

– качественное ПЦР исследование возбудителей урогенитальных инфекций, передаваемых половым путем, - Chlamidia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis и др.

Список использованной литературы

1. Анкирская А.С., Муравьева В.В. Опыт микробиологической диагностики оппортунистических инфекций влагалища // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерпия. 2001. т. 3. № 2. С. 190–194.

2. Савичева А.М. Лабораторная диагностика и терапия репродуктивно значимых инфекций // Лечащий врач. 2008. № 3. 

3. Brotman RM, Erbelding EJ, Jamshidi RM et al. Findings associated with recurrence of bacterial vaginosis among adolescents attending sexually transmitted diseases clinics // J. Pediatr Adolesc Gynecol. 2007 Aug. 20(4). Р. 225–31.

4. Ferris MJ, Masztal A, Aldridge KE. et al. Association of Atopobium vaginae, a recently described metronidazole resistant anaerobe, with bacterial vaginosis // BMC Infect Dis. 2004. Feb. 13. Р. 4–5.

5. Nugent RP, Krohn MA, Hillier SL. Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation // J. Clin Microbiol. 1991. Feb. 29(2). Р. 297–301.

6. Spiegel CA, Amsel R, Holmes KK. Diagnosis of bacterial vaginosis by direct gram stain of vaginal fluid // J Clin Microbiol. 1983. № 18. Р. 170–7.

7. Zhou X, Bent SJ, Schneider MG et al. Characterization of vaginal microbial communities in adult healthy women using cultivation-independent methods // Microbiology. 2004. Aug. 150(Pt 8). Р. 2565–73. 

Читайте в ближайших номерах журнала «Справочник заведующего КДЛ»
    Читать >>


    Ваша персональная подборка

      Подписка на статьи

      Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

      Рекомендации по теме

      Мероприятия

      Мероприятия

      Повышаем квалификацию

      Посмотреть

      Самое выгодное предложение

      Самое выгодное предложение

      Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

      Живое общение с редакцией

      А еще...








      Наши продукты






















      © МЦФЭР, 2006 – 2017. Все права защищены.

      Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

      Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
      Свидетельство о регистрации средства массовой информации ПИ № ФС77-64203 от 31.12.2015.

      Политика обработки персональных данных

      
      • Мы в соцсетях
      Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×