Перспективы иммуноферментного анализа в диагностике инфекций, передаваемых половым путем

5046
Перспективы иммуноферментного анализа в диагностике инфекций, передаваемых половым путем

Лабораторная диагностика урогенитальных инфекций предполагает решение следующих задач:

~ обнаружение микроорганизма в урогенитальном тракте или подтверждение факта наличия инфекции в анамнезе;

~ оценка жизнеспособности микроорганизма и определение стадии заболевания;

~ динамическое наблюдение в процессе терапии, контроль достижения излеченности.

В лабораторной практике применяют прямые и непрямые методы диагностики. К числу прямых методов, используемых для изучения инфекций урогенитального тракта, традиционно относят культуральные/бактериологические, методы прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) и полимеразной цепной реакции, позволяющие обнаружить непосредственно микроорганизм, или его антигены, или его генетический материал. Непрямыми принято считать методы диагностики, позволяющие косвенно судить о встрече организма человека с тем или иным микроорганизмом. К числу непрямых относится серологический метод (иммуноферментный и иммунохимический анализ), предназначенный для оценки иммунного ответа организма пациента на антигены бактерий и вирусов.

Обе группы методов имеют ряд преимуществ и недостатков. И, как известно, в клинико-лабораторной практике всегда приветствуется комплексный подход в решении диагностической задачи, а именно использование как минимум двух методов оценки инфицированности пациента.

Иммуноферментый анализ (ИФА) может применяться для частичного решения всех вышеперечисленных клинических задач. Для подтверждения факта наличия инфекции в анамнезе пациента традиционно используются тесты для выявления IgG-антител к антигенам того или иного микроорганизма. Для оценки стадии инфекционного заболевания в лаборатории оценивают дополнительно антитела IgA и IgM классов, являющиеся маркерами острой инфекции. Определение титров IgG и IgA (с интервалом 2 недели или 10 дней) проводят при динамическом наблюдении в процессе терапии. Диагностически значимым является 2–4-кратное изменение титра антител.

Тем не менее, несмотря на такую востребованность в клинико-лабораторной практике, ИФА не может считаться ведущим методом диагностики инфекции и тем более “золотым стандартом“. Как вариант лабораторной технологии, он является лишь дополнительным, уточняющим методом, и не только в силу своей принадлежности к группе непрямых методов.

Проблемы технологии ИФА можно условно разделить на внелабораторные и лабораторные. К первым относят низкую иммуногенность ряда микроорганизмов. В клинической практике нередко встречаются ситуации, когда иммунная система слабо или с опозданием отвечает развитием адекватного иммунного ответа на соответствующие антигены микроорганизма. Нередки случаи иммуносупрессии у обследуемых пациентов, обусловленные целым рядом причин. И в том и в другом случаях врач клинической практики может быть неудовлетворен результатами лабораторного анализа, т. к. серологический профиль инфекции действительно может не соответствовать наблюдаемой им клинической картине. В случае изучения иммунного ответа на антигены условно-патогенных микроорганизмов, выявление определенного титра антител не всегда является диагностическим критерием участия данного микроорганизма в патогенезе развития инфекции. Следует учитывать и определенные особенности уже развившегося иммунного ответа, который для каждого микроорганизма имеет свои особые черты: этапность синтеза разных классов антител, длительность их циркуляции в кровотоке, задействованность клеток памяти в поддержании иммунного ответа во времени и т. д.

Лабораторные проблемы технологии ИФА обусловлены особенностями тест-систем, используемых для диагностики, их конструкцией и составом реагентов. Присутствует проблема специфичности тест-систем, связанная с циркуляцией ревматоидного фактора у ряда пациентов и в той или иной степени решаемая производителем. К сожалению, имеется ограниченный спектр рекомбинантных белков, которые могут быть эффективно применены для создания высокоспецифичных ИФА-наборов. На сегодняшний день КДЛ имеют в своем распоряжении очень небольшое количество тест-систем, позволяющих проводить количественную оценку выявляемых антител, – для этого набор реагентов должен иметь в своем составе специальные аттестованные калибраторы и контроли, аттестацию которых желательно проводить относительно международных стандартов ВОЗ.

Однако, несмотря на перечисленные недостатки, все же не имеет смысла сбрасывать со счетов такой клинико-лабораторный метод, как ИФА, тем более что в рамках реализации национального проекта “Здоровье” лаборатории первичного звена ЛПУ практически повсеместного были оснащены соответствующим оборудованием.

У ИФА есть и свои преимущества перед прямыми методами диагностики, а именно:

~ возможность использования для массового скрининга;

~ относительная простота методики;

~ доступность биологического материала – сыворотки крови;

~ низкая себестоимость анализа;

~ возможность автоматизации и стандартизации процедуры анализа;

~ открытость метода – возможность использовать любые тест-системы.

В связи с вышеизложенным попробуем несколько иначе, по-новому взглянуть на применение технологии ИФА в диагностике урогенитальных инфекций.

В зависимости от клинических задач, которые будут поставлены перед лабораторией, возможны три уровня применения ИФА в диагностике инфекций, передаваемых половым путем (ИППП).

Качественный вариант анализа необходим при массовом скрининге населения и для типирования вирусоносительства. В данном случае лаборатории достаточно определять только IgG-антитела, причем определять титр антител не требуется.

Количественный вариант анализа применяется для динамического наблюдения в процессе терапии с помощью исследования парных сывороток. Данный вариант допускает анализ антител разных классов. Результат выдается лабораторией в титрах (в МЕ/мл или в РЕ/мл). Конечно, в этом случае потребуются количественные тест-системы, содержащие соответствующие калибраторы и контроли. Дополнительно следует иметь в виду, что разовое определение титра антител диагностической значимости не имеет и, если пациент не может быть обследован повторно, нет смысла использовать дорогую количественную тест-систему.

Для урогенитальных инфекций не существует понятия протективного титра антител. Одна из особенностей ИППП состоит в том, что пациент приходит к врачу-клиницисту, а затем в лабораторию, когда срок инфицирования определить уже затруднительно, клиническая симптоматика присутствует в “стертой” форме, возможны наличие микст-инфекции, применение антибиотикотерапии в анамнезе по ряду причин, не связанных с текущим состоянием пациента. Все эти факторы, в том или ином сочетании, приводят к тому, что титр антител на момент однократного обследования (любого класса антител) у каждого пациента абсолютно индивидуален.

И, наконец, наиболее интересный и перспективный уровень применения технологии ИФА в диагностике урогенитальных инфекций – определение антител к особым, клинически значимым белкам.

Рассмотрим три предложенных уровня применения ИФА на примере диагностики герпесвирусной и хламидийной инфекций.

На сегодняшний день известно восемь вирусов герпеса, контагиозных для человека (табл.). Вирусы герпеса человека (ВГЧ) пронумерованы ВОЗ и поделены на подсемейства.

Перспективы иммуноферментного анализа в диагностике инфекций, передаваемых половым путем

Инфицированность популяции каждым из видов ВГЧ различна. Максимальное распространение среди населения (по частоте выявляемости) имеют: ВПГ-1, ЦМВ, ВВО, ВЭБ и ВПГ-2. Герпесвирусная инфекция (ГВИ) является оппортунистической и сопровождается пожизненной латенцией. Таким образом, каждый индивидуум в популяции может быть носителем некоторой “коллекции” герпесвирусов. Поэтому первый уровень применения ИФА, в контексте изучения ГВИ, в виде определения IgG-антител (качественно) к антигенам того или иного вируса решает вопрос типирования вирусоносительства, определения герпетической нагрузки у конкретного пациента, что возможно осуществить в условиях массового скрининга.

Второй уровень – оценка концентрации IgG-антител в парных сыворотках, полученных от пациента при динамическом наблюдении в процессе подтверждения диагноза или терапии. Возможно определение антител класса IgM – как маркеров острой инфекции.

Третий уровень – определение разных классов антител к клинически значимым белкам того или иного ВГЧ.

Белки вирусов герпеса принято классифицировать на структурные и неструктурные. К первым относят белки, которые составляют капсид и имеются в составе липопротеидной оболочки вируса. Неструктурные белки кодируются геномом вириона, появляются при его активации и обуславливают процесс внутриклеточной репродукции вируса на разных его этапах. То есть это особые регуляторные белки и ферменты, которых в составе “готовой” вирусной частицы нет. Каждый из этих типов белков по времени синтеза в ходе инфицирования клетки условно делят на сверхранние (или предранние), ранние и поздние. Сверхранние и ранние неструктурные белки образуются в пораженной клетке на начальных стадиях вирусной репликации еще до начала синтеза вирусной ДНК. Эти белки уже могут экспрессироваться на поверхности клетки-мишени, оцениваться иммунной системой пациента как чужеродные антигены и тем самым вызывать синтез антител. Затем вирус синтезирует ранние и поздние структурные белки. Характерной чертой ВГЧ является каскадный характер синтеза вирусных белков. Это означает, что белки синтезируются последовательно, причем ранее синтезированные молекулы регулируют синтез последующих.

Данное отступление позволяет понять, что изучить активность ГВИ, ее стадию можно по оценке разных классов антител к перечисленным неструктурным и структурным белкам. Выявление указанных антител позволяет судить об активной репликации вируса и обострении ГВИ.

Подобный подход успешно применяется пока только при диагностике трех видов герпеса – ВЭБ, ВВО и ЦМВ. Серологический профиль ВЭБ-инфекции анализируют с использованием тест-систем для оценки разных классов антител к VCA, ЕА и NA-1 белкам ВЭБ, ЦМВ-инфекции – по антителам к IE и рр150 белкам ЦМВ; ВВО-инфекции – по антителам к гликопротеину Е ВВО.

ИФА тест-системы, применимые на третьем уровне диагностики, выпускаются как зарубежными, так и отечественными производителями. Их использование позволяет, в некоторых случаях, с точностью до недели дать ответ либо о моменте инфицирования ВГЧ, либо рецидиве ГВИ.

С этих же позиций можно рассмотреть хламидийную инфекцию. Предварительно остановимся на антигенном составе хламидийной клетки. Известно, что наиболее иммуногенны три белка Ch.trachomatis – MOMP, HSP60 и белок, кодируемый плазмидой, – pgp3. Именно на эти белки иммунная система человека наиболее интенсивно отвечает продукцией антител. MOMP – белок наружной мембраны хламидийной клетки – составляет порядка 60% всех белков оболочки. MOMP является основным (главным) антигеном Ch.Тrachomatis и первым распознается нашей иммунной системой. IgM-антитела к MOMP образуются примерно через 10 дней после первичного инфицирования.

Pgp3 – внутренний, мембранассоциированный белок, кодируемый плазмидой, который синтезируется в процессе жизненного цикла хламидий. Он распознается нашей иммунной системой позднее, после многократного повторения жизненного цикла хламидий. Антитела к pgp3 появляются вслед за антителами к MOMP, и их обнаружение указывает на то, что хламидии не только проникли в организм, но и начали активно размножаться. Антитела к pgp3 являются маркерами хронизации процесса. Введение теста на определение pgp3 в иммуноферментную тест-систему существенно повышает ее специфичность. Как показывает клиническая практика применения таких наборов, примерно у 20% пациентов с хронической хламидийной инфекцией IgG к МОМР могут уже не определяться (существенно снижается титр), в то время как IgG к pgp3+МОМР все еще обнаруживаются. Пациенты с таким серологическим ответом, конечно, требуют дополнительного наблюдения и коррекции терапии.

И третий по значимости белок Ch.trachomatis – это HSP60, белок теплового шока. Белки теплового шока – шапероны – давно известны биологам. Синтез шаперонов характерен для клеток всех типов живых организмов – бактерий, грибов, растений. HSP60 синтезируются клетками в ответ на воздействие стрессовых факторов окружающей среды. Эти белки помогают клетке выжить в условиях стресса и вернуться к нормальной жизни после прекращения воздействия агрессивных факторов.

У хламидий HSP60 появляется только у L-форм, и обнаружение антител к нему укажет нам на L-трансформацию. L-трансформация – естественная приспособительная реакция хламидийной клетки в ответ на неблагоприятное воздействие со стороны организма хозяина, которая выражается в нарушении жизненного цикла хламидий.

L-трансформация характерна для персистентных и латентных форм хламидиоза. С морфологической точки зрения такой защитный механизм реализуется путем резкого снижения синтеза основных белков клеточной стенки хламидий – МОМР и ОМР. Синтез же белка теплового шока HSP60, напротив, резко возрастает, что усиливает ригидность клеточной стенки, придает ей особую жесткость. Такие существенные изменения в структуре мембраны микроорганизма приводят к тому, что L-формы не растут на используемых для выделения хламидий клеточных культурах.

На первом уровне ИФА-диагностики хламидиоза в основном применяются тест-системы для выявления антител класса IgG (к МОМР), что проводится в условиях массового скрининга. Но возможно и использование тест-систем для оценки всех трех классов антител – IgG, IgA, IgM (к МОМР), причем IgA и IgM-антитела будут маркерами ранней (острой) инфекции. Следует упомянуть, что выявляемость антител первичного инфицирования при хламидиозе – относительно редкое явление, но связано это не с качеством используемых тест-систем, а со сроками обращения пациентов за помощью.

В рамках динамического наблюдения (второй этап ИФА-диагностики) применяют аналогичные тест-системы. Исследуются парные сыворотки, ответ выдается лабораторией в титрах. Антителами, наиболее быстро реагирующими на терапию, считаются IgA-антитела к МОМР. Именно этот класс антител имеет смысл оценивать в процессе лечения пациентов, если, конечно, они были обнаружены при первичном обследовании.

Третий уровень применения ИФА необходим и востребован при подозрении на наличие различных форм тяжелой хронической хламидийной инфекции. На этом этапе применяют тест-системы для выявления анти-Pgp3-IgG-антител и анти- HSP60-IgG-антител, которые являются маркерами хронизации хламидиоза и L-трансформации хламидийной клетки. Действительно, при тяжелой, затяжной инфекции нередки находки IgG к Pgp3, при отрицательном ответе на двух предыдущих этапах диагностики. В свою очередь, антитела против HSP60 на сегодняшний день являются единственными маркерами нарушения жизненного цикла хламидийной клетки, маркерами латентной формы инфекции.

Мы рассмотрели три уровня применения ИФА в диагностике двух инфекций. Будем надеяться, что прогрессивное развитие молекулярно-биологических технологий в ближайшем будущем откроет перед специалистам КДЛ новые перспективы применения этого клинико-лабораторного метода.

Список использованной литературы

1. Герпес – неизвестная эпидемия. Составитель Абазова Ф.И. Смоленск, 1997.

2. Таранов А.Г. Лабораторная диагностика в акушерстве и гинекологии. Справочник. М., 2004.

3. Баткаев Э.А., Липова Е.В. Урогенитальный хламидиоз. Пособие для врачей. М., 2004.

4. Европейские стандарты дианостики и лечения заболеваний, передающихся половым путем. М., 2004.

5. Лобзин Ю.В. и соавт. Хламидийные инфекции. СПб., 2003.

Читайте в ближайших номерах журнала «Справочник заведующего КДЛ»
    Читать >>


    Ваша персональная подборка

      Подписка на статьи

      Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

      Рекомендации по теме

      Мероприятия

      Мероприятия

      Повышаем квалификацию

      Посмотреть

      Самое выгодное предложение

      Самое выгодное предложение

      Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

      Живое общение с редакцией

      А еще...








      Наши продукты






















      © МЦФЭР, 2006 – 2017. Все права защищены.

      Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

      Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
      Свидетельство о регистрации средства массовой информации ПИ № ФС77-64203 от 31.12.2015.

      Политика обработки персональных данных

      
      • Мы в соцсетях
      Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×