text

🎁 УЛЁТНЫЕ СКИДКИ 30%! Поймать »

Здравоохранение

Опыт использования метода ПЦР для выявления РНК (ДНК) возбудителей вирусных гепатитов В и С у серонегативных доноров

  • 2 октября 2012
  • 7151
Опыт использования метода ПЦР для выявления РНК (ДНК) возбудителей вирусных гепатитов В и С у серонегативных доноров

В настоящее время исследование образцов донорской крови для выявления маркеров вирусного гепатита В (ВГВ) и вирусного гепатита С (ВГС) проводят иммуноферментным (ИФА) или иммунохемилюминисцентным (ИХЛА) методами, позволяющими определять наличие в пробе крови поверхностного антигена вируса гепатита B (HBsAg) и антител к белкам вируса гепатита С (анти-HCV). Внедрение в лабораторную практику службы крови обязательного тестирования донорской крови для выявления названных маркеров позволило значительно снизить риск посттрансфузионной передачи вирусов гепатита В и С.

Известно, однако, что при ВГС специфические антитела появляются в среднем через 10–12 недель от момента заражения, а в некоторых случаях сроки их появления могут отодвигаться до 30–50 недель [2, 6]. Поэтому при исследовании методами ИФА или ИХЛА образцов крови, взятой у донора с ранней стадией ВГС, когда антитела еще не выявляются (период так называемого серонегативного окна), получают, как правило, ложноотрицательный результат. В то же время именно в этот период ВГС наблюдается выраженная виремия и связанная с ней высокая “инфекционная способность” инфицированной крови [2, 3, 6]. В связи с этим компоненты крови, заготовленные от донора, находящегося в периоде серонегативного окна, являются основным источником заражения реципиента ВГС при гемотрансфузии.

Внимание! Для скачивания доступна новая книга:  «Молекулярно-биологические исследования» ,

Использование NAT-технологий, в частности метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяет выявить РНК HCV в крови уже через 1–2 недели после заражения, т. е. приблизительно за 60 дней до выявления анти-HCV серологическими тестами [8].

HBsAg в большинстве случаев является наиболее значимым серологическим маркером острого и хронического ВГВ, и выявление его в крови с высокой степенью вероятности свидетельствует о присутствии вируса [1, 2, 5, 6]. Однако зарегистрированы случаи заражения ВГВ при переливании HBsAg-негативной крови [7]. В настоящее время известно о существовании по крайней мере двух “ускользающих” (escape) мутаций HBsAg [9], которые могут возникать как естественным путем в ходе инфекционного процесса, так и после противовирусной терапии. Эти штаммы HBV способны передаваться горизонтальным путем и обусловливать ложноотрицательный результат при скрининге донорской крови на HBsAg. Описана так называемая “молчащая” форма ВГВ, характеризующаяся наличием низких концентраций вируса в крови при недетектируемом уровне HBsAg [2]. Она может наблюдаться у некоторых больных после острого ВГВ с самостоятельным разрешением и даже после успешно проведенного противовирусного лечения, а также при хроническом ВГВ. Установлено, что “молчащая” инфекция представляет клиническую форму ВГВ, способную передаваться через компоненты крови, а диагностика ее основывается на тщательном сборе анамнеза и применении высокочувствительного метода ПЦР для определения вирусной ДНК [1].

Задачей настоящей работы было оценить целесообразность использования метода ПЦР для скрининга донорской крови на наличие маркеров ВГС и ВГВ.

Пробы крови от каждого донора забирали в 2 пробирки: пробирку с разделительным гелем для получения сыворотки для серологических исследований и пробирку с ЭДТА для получения плазмы для ПЦР.

Выявление серологических маркеров ВИЧ 1, 2, ВГВ и ВГС проводили методом ИФА с использованием анализатора Evolis (компания Bio-Rad, США) или методом ИХЛА с использованием анализатора Architect (компания Abbott, США).

Для определения антител к HCV методами ИФА и ИХЛА использовали, соответственно, тест-системы Murex anti HCV (Abbott, США) и тест-системы Architect anti HCV (Abbott, США).

Для выявления HBsAg методом ИФА использовали тест-системы Monolisa HBsAg Ultra (Bio-Rad, США) и тест-системы Architect HBsAg (Abbott, США).

Образцы, показавшие при первичном исследовании методами ИФА или ИХЛА положительный результат на наличие анти-HIV 1, 2, анти-HCV или HBsAg, отбирали для повторного исследования с использованием тех же тест-систем, а также подтверждающих тестов.

Все серонегативные образцы исследовали методом ПЦР для выявления РНК HIV, HCV и ДНК HBV.

В течение 2008 г. ПЦР-исследования проводили на приборах Cobas Ampliprep/ Cobas Amplicor (компания Roch, Швейцария) с использованием тест-систем Cobas Ampliprep/Cobas Amplicor HIV 1 Monitor Test, Cobas Ampliprep/ Cobas Amplicor HCV Test и Cobas Amplicor HBV Monitor Test.

С января 2009 г. исследования выполняли методом ПЦР в режиме реального времени на инструментальном комплексе Cobas 201 (Roche, Швейцария), включающем пипетирующую рабочую станцию, аппарат для автоматического выделения нуклеиновых кислот Cobas Ampliprep и анализатор Cobas Taqman для автоматического проведения амплификации и детектирования нуклеиновых кислот с использованием 5′-нуклеазной технологии.

Многоканальные оптические системы прибора позволяют регистрировать флуоресцентный сигнал от исследуемого образца в каждом цикле ПЦР. Для ПЦР-анализа серонегативных образцов использовали мультиплексные тест-системы CobasTaqScreen MPX Test, разработанные компанией Roche специально для скрининга донорской крови. За счет включения в реакционную смесь различных пар специфических праймеров и зондов эти системы позволяют выявлять одновременно в одной пробирке РНК HIV-1 группы М и группы О, HIV-2, HCV и ДНК HBV. Образцы, при исследовании которых регистрировали нарастание флуоресцентного сигнала, считали положительными, т. е. содержащими вирусную РНК (ДНК). Такие образцы исследовали повторно с использованием той же тест-системы. При получении повторно положительного результата проводили идентификацию выявленной нуклеиновой кислоты с помощью указанных выше ПЦР-диагностикумов на обнаружение отдельных инфекций.

При исследовании 56 983 серонегативных образцов донорской плазмы на наличие вирусной РНК (ДНК) на приборах Cobas Ampliprep/Cobas Amplicor при использовании наборов реагентов для отдельного выявления РНК HIV, HCV и ДНК HBV было выявлено 8 образцов, содержащих РНК HCV. При этом РНК HIV-1 и ДНК HBV ни в одном из исследованных образцов обнаружено не было.

При исследовании 62 438 серонегативных образцов на аппаратном комплексе Cobas 201 с помощью тест-систем CobasTagScreen МРХ в 31 случае было зарегистрировано нарастание флуоресцентного сигнала, свидетельствующее о наличии в образце вирусной РНК (ДНК). Дискриминатор ный анализ этих образцов с помощью тест-систем для отдельного выявления РНК HIV, HCV и ДНК HBV выявил в 16 из них РНК HCV, в 4 других – ДНК HBV в низкой концентрации (менее 60 МЕ/мл). Остальные 11 образцов, положительные при использовании теста CobasTagScreen МРХ, показали отрицательный результат раздельного выявления РНК HIV-1, РНК HCV и ДНК HBV. Однако при исследовании образцов, содержащих ДНК HBV, и образцов с неидентифицированной нуклеиновой кислотой (наличие ДНК не подтверждено системой для отдельного выявления РНК/ДНК) на наличие анти-НВсоr (таблица) во всех случаях выявили выраженную серологическую реакцию (коэффициент позитивности колебался в пределах от 7,8 до 8,6).

В 4 образцах были также обнаружены антитела к HBsAg (таблица). Наличие в образцах с неидентифицированной нуклеиновой кислотой серологических маркеров инфекции позволяет считать, что в них присутствует ДНК HBV в концентрации ниже предела чувствительности теста Cobas Amplicor HBV Monitor (40 МЕ/мл), выявляемая, однако, более чувствительной тест-системой CobasTagScreen MPX (3,3–4,4 МЕ/мл).

Опыт использования метода ПЦР для выявления РНК (ДНК) возбудителей вирусных гепатитов В и С у серонегативных доноров

Обобщая полученные результаты, мы установили, что из 119 421 образцов донорской плазмы, показавших отрицательный результат в серологических тестах, методом ПЦР выявлено 24 образца (0,02%), содержащих РНК HCV. Нормальный уровень трансаминаз имели 16 доноров, образцы которых были HCV–позитивными, в то время как в 8 других в крови был зарегистрирован повышенный уровень активности АЛТ. Подобная картина может наблюдаться в период серонегативного окна и при хроническом ВГС у лиц с подавленным иммунитетом. Данные литературы, свидетельствующие об отсутствии прямой зависимости между уровнем АЛТ и наличием РНК HCV в сыворотке крови [4], позволяют считать, что обнаружение РНК HCV в крови является наиболее информативным показателем инфекции в период серонегативного окна.

Также нами было выявлено 11 образцов, содержащих ДНК HBV у HBsAg-негативных доноров, в том числе в четырех сохранялся низкий уровень виремии, несмотря на наличие анти-HBs. Известно, что подобное состояние иногда может наблюдаться длительное время после клинического выздоровления от острого ВГВ. Предполагают, что персистенция вируса в этом случае может осуществляться в форме иммунного комплекса с анти-HBs.

В остальных случаях сочетание низкого уровня виремии с наличием только анти-НВсог скорее укладывается в картину “молчащей” формы хронического ВГВ. Считают, что отрицательные результаты при детекции HBsAg у больных ВГВ могут быть вызваны низким уровнем HBsAg, образованием иммунных комплексов, а также мутациями вируса в S-регионе. Механизмы, поддерживающие низкий уровень репликации вируса при “молчащей” форме ВГВ, нуждаются в дальнейшем изучении. В настоящее время к факторам, способным поддерживать персистенцию вируса гепатита B в крови при “молчащей” инфекции, относят инфицирование вирусом моноцитов крови, формирование иммунных комплексов с антителами, ослабленный иммунитет и коинфекцию.

Таким образом, на основании полученных результатов можно заключить, что скрининг образцов донорской крови с применением ПЦР-тестирования для выявления вирусной РНК (ДНК) позволит снизить риск посттрансфузионной передачи вирусов гапатита В и С за счет выявления инфицированных доноров, находящихся в периоде серонегативного окна, и доноров с “молчащей” формой инфекции. Алгоритм апробации донорской крови, при котором скрининг образцов методом ПЦР проводят одновременно с выполнением серологических тестов, позволит не только повысить инфекционную безопасность гемопродукции, но и сократить промежуток времени от момента забора крови до передачи ее в лечебные учреждения, что особенно важно для сохранения компонентов с ограниченным сроком годности.

Список использованной литературы

  1. Амосов А.Д. Гепатит В. 2-е изд. Кольцово, 2001. 128 с.
  2. Голосова Т.В., Никитин И.К. Гемотрансмиссивные инфекции. М., 2003. 191 с.
  3. Карякин А.В., Скоцеляс Е.Д., Терентьева Л.А. Мониторинг безопасности донорского контингента России // Трансфузиология. 2007. № 1–2.
  4. Майер К.П. Гепатит и последствия гепатита / пер. с нем. М.: ГЭОТАР Медицина, 1999. С. 91–98.
  5. Малышев B.C., Федорова В.Д., Потехин О.Е. Маркеры вирусного гепатита В у доноров крови и в группах сравнения // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 1999. № 1. С. 103–105.
  6. Рагимов А.А., Дашкова Н.Г. Основы трансфузионной иммунологии. М.: МИА, 2004. 280 с.
  7. Allain J.P. Occult hepatitis В virus infection: implication in transfusion // Vox Sang. 2004. Vol. 86. № 2. Р. 83–91.
  8. Busch M.P., Glynn S.A., Strainer S.L. et al. A new strategy for estimating risk of transfusion-transmitted viral infections based on rates of detection of resently infected donors // Transfusion. 2004. Vol. 45. P. 254–264.
  9. Gutierrez C., Devesa M., Loureiro C.L. et al. Molecular and serological evaluation of surface antigen negative hepatitis В virus infection in blood from Venezuela // J. Med.Virol. 2004. Vol. 3. №. 2. Р. 200–207. 
Рекомендации по теме

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Мы в соцсетях
А еще:
Сайт предназначен для медицинских работников!


Материалы для zdrav.ru готовят лучшие эксперты в сфере здравоохранения. Чтобы защитить их авторские права, многие статьи на нашем сайте закрыты

Подтвердите ваш статус медработника - регистрация займет одну минуту.

Пакет готовых инструкций, чтобы пройти проверку Росздравнадзора в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Зарегистрироваться
Сайт предназначен для медицинских работников!


Материалы для zdrav.ru готовят лучшие эксперты в сфере здравоохранения. Чтобы защитить их авторские права, многие статьи на нашем сайте закрыты

Подтвердите ваш статус медработника - регистрация займет одну минуту.

Пакет готовых инструкций, чтобы пройти проверку Росздравнадзора в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Зарегистрироваться
×
Журнал
Гость, Ваш бесплатный доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ» сгорает через

Гость, вам предоставлен VIP-доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ»:
возможность скачивать шаблоны • доступ к видеотренингам • книги для КДЛ
Активировать доступ  
Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.