Выбор методов микроскопического выявления и культурального выделения микобактерий

2474

Выявление возбудителя в диагностическом материале и выделение культуры микобактерии является единственно достоверным доказательством туберку­лезной этиологии процесса. Однако только выделение микобактерий туберку­леза не может обеспечить эффективности проводимого курса химиотерапии.

Задача микобактериологической лаборатории состоит в том, чтобы выде­лить культуру возбудителя, установить его вид и определить лекарственную чувствительность к противотуберкулезным препаратам. Подтверждение тубер­кулезной этиологии и сведения о лекарственной чувствительности возбудителя имеют решающее значение для выбора наиболее рациональной схемы противо­туберкулезной терапии, правильной оценки ее эффективности и прогнозиро­вания течения процесса.

Максимально быстрое выявление возбудителя у лиц с подозрением на наличие туберкулезной инфекции сертифицированными методами микробиологиче­ской диагностики, определение его вида и характеристики лекарственной чув­ствительности являются основными показателями, определяющими эффектив­ность работы специализированной микобактериологической лаборатории. Приказом Минздрава России от 21.03.2003 № 109 "О совершенствовании про­тивотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации" утверждена Ин­струкция по унифицированным методам микроскопических исследований для выявления кислотоустойчивых микобактерий в клинико-диагностических ла­бораториях лечебно-профилактических учреждений: окраска по методу Ziehl -Neelsen для исследования в световом микроскопе и окраска флуорохромными красителями для исследования в люминесцентном микроскопе.

Достичь какого-либо успеха в организации активного участия КДЛ общей лечебной сети в выявлении наиболее эпидемически опасной категории массивных бактериовыделителей методом прямой микроскопии нативного мазка мо­кроты пока не удается. Показатель частоты выявления туберкулеза органов ды­хания при профилактических обследованиях населения, по данным аналитического обзора эпидемиологической ситуации по туберкулезу в г. Мо­скве за 2008 г., составил 1,0 на 1 тыс. обследованных (в поликлинических под­разделениях - 0,5%, в стационарах общей лечебной сети - 3,4%). Причиной этого является пока еще недостаточная оснащенность КДЛ современным обо­рудованием, а также недостаточный уровень подготовки лабораторных работ­ников в части интерпретации результатов микроскопии мазков, окрашенных специальными методами для выявления микобактерий.

Положительными качествами методов выявления больных туберкулезом путем бактериоскопии мазков, приготовленных непосредственно из диагности­ческого материала (метод прямой микроскопии) или из осадка, обработанного для культурального исследования, является то, что ответ можно получить бы­стро и для приготовления мазка и его окраски не требуется дорогостоящего оборудования и длительного времени. В то же время результативность методов микроскопии ограничена предельным содержанием микобактерий, ко­личество которых в 1 мл материала должно быть не менее 104 микробных кле­ток при микроскопии мазков, окрашенных по Ziehl - Neelsen, и порядка 103 -при окраске флуорохромами. На начальных стадиях заболевания, когда количество выделяемых микобактерий ниже предела чувствительности мето­дов, бактериоскопия может оказаться недостаточной для их выявления.

Методы микроскопического выявления микобактерий носят предупреди­тельный противоэпидемический характер, оставаясь одними из общепринятых на первичных этапах обследования пациентов и при динамическом наблюдении за состоянием бактериовыделения в процессе лечения. В то же время этот метод должен быть использован в комплексе с другими методами.

Затруднения в обнаружении микобактерий туберкулеза (МБТ) методом бактериоскопии возникли в связи с увеличением среди впервые выявленных больных лиц с умеренным и скудным бактериовыделением.

Длительное применение противотуберкулезных препаратов (ПТП) приве­ло к глубоким изменениям как морфологических, так и биохимических свойств возбудителя. Изменения ультраструктуры и функции микобактериальной клет­ки привели к утрате в ряде случаев кислотоустойчивости и, как следствие, обесцвечиванию при окраске. В связи с этим подтверждение туберкулезной этиологии процесса только микроскопическими методами является абсолютно недостаточным. К тому же проявление полиморфизма возбудителя туберкулеза в результате длительного применения ПТП требует детального его изучения с использованием современных методов исследования. Это диктует необходи­мость, наряду с бактериоскопическими методами, обязательного применения в комплексе исследований бактериологических, молекулярно-биологических и хроматографических методов лабораторной диагностики.

Метод посева на плотные питательные среды имеет несомненные преиму­щества перед бактериоскопическим и является весьма информативным. С по­мощью культурального исследования можно обнаружить значительно меньшее, чем при микроскопии, количество МБТ в пробах и тем самым увеличить число выявляемых бактериовыделителей, расширить критерии оценки прекра­щения бактериовыделения за счет олигобациллярных больных, продолжающих выделять малые количества микобактерий и признанных излеченными на осно­вании отрицательных результатов микроскопии мазка мокроты.

При длительном специфическом лечении создаются условия для селекцио­нирования штаммов с измененными свойствами. Практика показывает, что та­кие микобактерии часто теряют способность к репродукции в лабораторных условиях. Поэтому среди вновь выявленных больных возрастает олигобацил-лярность. В случаях олигобациллярности проблема выделения МБТ из матери­ала становится особенно актуальной, т. к. это должно послужить врачу поводом для более детального обследования пациента.

Метод культурального исследования, направленный на выделение чистой культуры возбудителя, заключается в применении и использовании классиче­ских приемов деконтаминации диагностического материала и посева его на плотные питательные среды. Этот метод значительно информативнее ми­кроскопии, т. к. для получения роста достаточно первоначального содержания кислотоустойчивых микобактерий в 1 мл материала в количестве нескольких десятков микробных тел.

Открытие в 1882 г. Робертом Кохом возбудителя туберкулеза поставило перед микробиологами задачу разработки методов щадящей обработки диагно­стического материала для последующего выделения культуры на питательных средах. За более чем вековую историю вопроса в практике бактериологической диагностики туберкулеза были предложены десятки культуральных методов и модификаций питательных сред, а также вариантов их сочетания для выделе­ния туберкулезных культур.

В лабораторной диагностике туберкулеза для выделения культуры возбуди­теля применяется целый спектр питательных сред, в основном трех вариантов:

  • жидкие - Nokard (1887), Проскауэра - Бека (1894), Сотона (1912), Е.А. Школьниковой (1947), Middlbrook 7Н9 (1947), Дюбо (1952) и др.;
  • полужидкие - среда Е.А. Школьниковой с добавлением агара;
  • плотные:

- яичные

Левенштейна (1924 г.), Йенсена (1932), С.И. Гельберга (1935), Огава (1949), Г.Г. Мордовского (1970), Э.Р. Финна № 1 и 2 (1973), а также Попеску, В.А. Аникина и др.;

- агаровые

Middlbrook 7Н10, Middlbrook 7Н11.

В 1955 г. Всемирной организацией здравоохранения в качестве междуна­родной стандартной питательной среды была принята плотная яичная среда Левенштейна в модификации Йенсена. В качестве второй стандартной среды в противотуберкулезных учреждениях России принята среда Финна № 2.

Даже при достаточно высокой результативности применения унифициро­ванных плотных питательных сред (Левенштейна - Йенсена, Финна и др.) велся постоянный поиск способов повышения их эффективности или новых субстра­тов для выделения культур МБТ. В практике культуральных исследований были предложены среды для выращивания L-форм микобактерий. В определенный период поисков и находок предпочтение отдавалось жидким питательным средам Миддлбрука, Школьниковой, ранний и интенсивный рост на которых удавалось получать за счет аэрации инокулята и идеальной диффузии ингредиентов. Не­смотря на преимущество жидких сред в сравнении с плотными, широкого прак­тического применения жидкие питательные среды не нашли, т. к. изучение лекар­ственной чувствительности микобактерий требовало количественного учета массивности бактериовыделения.

К настоящему времени нет ни одной среды, позволяющей получить рост всех жизнеспособных микобактерий при посевах различного диагностического материала. Рекомендованы разнообразные щадящие методы обработки иссле­дуемого материала, предложено использование различных добавок к питатель­ным средам и комбинации их применения, сред с разным уровнем кислотности и солевого состава, обеспечивающих наиболее результативную культуральную диагностику бактериовыделения при туберкулезе. Однако ни одна из сред не эф­фективна для избирательного выделения конкретных штаммов и не обеспечива­ет сокращение сроков выделения культуры МБТ. Успехов в преодолении послед­него фактора на плотных питательных средах достичь не удается до настоящего времени.

В практике работы Централизованной бактериологической лаборатории (ЦБЛ) для научных экспериментов применяется жидкая среда Школьниковой в сочетании с плотной средой Левенштейна - Йенсена, для рутинных исследова­ний диагностического материала - сочетание плотных питательных сред Левен-штейна - Йенсена и Финна № 2, для ускоренного выявления бактериовыделите-лей среди первично обследованных пациентов в автоматизированных приборах BactecTMMGITTM960 - жидкая среда Middlbrook 7Н9 также в сочетании с плот­ной средой Левенштейна - Йенсена. Для выделения чистой культуры и после­дующей идентификации нетуберкулезных микобактерий - агаровые среды Middlbrook 7Н10 и Middlbrook 7Н11.

В ЦБЛ разработан алгоритм выделения и идентификации M. tuberculosis из диагностического материала с использованием комплекса бактериологических и молекулярно-диагностических тестов. Это позволяет клиницистам уже в первые сутки получить предварительные данные о видовой принадлеж­ности возбудителя (первичная предварительная идентификация с использова­нием тест-системы ТБ-БИОЧИП).

Выделение культуры микобактерий на жидкой питательной среде Middlbrook 7Н9 в автоматизированных приборах BactecTMMGITTM960 проводится в среднем в сроки от 5 до 22 суток. Мазок культуры, окрашенный по методу Ziehl - Neelsen, подлежит обязательной микроскопии для подтверждения ее кислотоустойчиво-сти и первичных данных, полученных с помощью тест-системы ТБ-БИОЧИП.

Положительный результат посева материала на плотных питательных сре­дах регистрируется в среднем в сроки от 19 до 81 суток. Мазок, приготовленный из этой культуры и окрашенный по методу Ziehl - Neelsen, также подлежит ми­кроскопии для подтверждения кислотоустойчивости культуры.

В случае получения данных о принадлежности выделенной микобактерии к нетуберкулезным микобактериям, культура направляется для определения ее вида культуральными, биохимическими тестами и высокоэффективной жид­костной хроматографией.

Проведенные исследования 227 культур позволили оценить эффективность питательных сред различного состава, применяемых в ЦБЛ для выделения и пер­вичной видовой идентификации кислотоустойчивых микобактерий (таблица).

Эффективность применения различных питательных сред для выделения микобактерий

Число (%) микобактерий, выделенных на среде

Вид микобактерий

Левенштейна -Йенсена

Миддлбрука 7Н11

Миддлбрука 7Н9 (BACTEC™MGIT™960)

M. tuberculosis (186)

139 (74,7)

150 (80,6)

169 (90,9)

Нетуб еркуле зные микобактерии (41)

27 (65,9)

30 (73,2)

35 (85,4)

ИТОГО (227)

166 (73,1)

180 (79,3)

204 (89,9)

Из 186 идентифицированных культур M. tuberculosis на плотной яичной среде Левенштейна - Йенсена выделено 139 (74,7%), на агаровой среде Middlbrook 7Н11 - 150 (80,6%), на жидкой питательной среде Middlbrook 7Н9 в автоматизи­рованной системе BactecTMMGITTM960 - 169 (90,9%). Выделена 41 культура не­туберкулезных микобактерий различного видового состава: на среде Левен-штейна - Йенсена - 27 (65,9%), на среде Middlbrook 7Н11 - 30 (73,2%), на среде Middlbrook 7Н9 - 35 (85,4%).

Таким образом, на основании полученных результатов можно заключить, что для выделения микобактерий как туберкулезного, так и нетуберкулезного комплекса наиболее эффективна жидкая среда Middlbrook 7Н9 - 204 культуры (89,9%), затем агаровая среда Middlbrook 7Н11 - 180 культур (79,3%) и, наконец, плотная яичная питательная среда Левенштейна - Йенсена - 166 культур (73,1%).

Г.Е. Фрейман,
зав. Централизованной бактериологической лабораторией,

М.В. Макарова,
канд. биол. наук, науч. сотр. отдела проблем лабораторной диагностики туберкулеза,
Московский городской научно-практический центр борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы (МНПЦБТ)

Читайте в ближайших номерах журнала «Справочник заведующего КДЛ»
    Читать >>


    Ваша персональная подборка

      Подписка на статьи

      Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

      Рекомендации по теме

      Мероприятия

      Мероприятия

      Повышаем квалификацию

      Посмотреть

      Самое выгодное предложение

      Самое выгодное предложение

      Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

      Живое общение с редакцией

      А еще...








      Наши продукты






















      © МЦФЭР, 2006 – 2017. Все права защищены.

      Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

      Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
      Свидетельство о регистрации средства массовой информации ПИ № ФС77-64203 от 31.12.2015.

      Политика обработки персональных данных

      
      • Мы в соцсетях
      Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×