Иммуноблоттинг: современная диагностика ревматоидного артрита

15280
Иммуноблоттинг: современная диагностика ревматоидного артрита

Прогресс в области современной экспериментальной и клинической иммуноло­гии позволяет проводить достаточно эффективную лабораторную диагностику ревматоидного артрита (далее - РА). Применяемые методики дают возмож­ность получить объективную информацию о характере иммунопатологических изменений, являясь важным инструментом для диагностики, оценки активно­сти, определения прогноза, выбора метода лечения болезни и мониторинга эф­фективности проводимой терапии.

Иммуноблоттинг: диагностика ревматоидного артрита

Современная лабораторная диагностика РА основана на принципах доказательной медицины, что обеспечивает опти­мальный выбор и использование иммунологических методов, среди которых наиболее информативными являются тесты, связанные с обнаружением цирку­лирующих аутоантител и маркеров острой фазы воспаления (табл. 1, 2).

Аутоантитела

ИммуноблоттингСтандартным иммунологическим маркером РА является ревматоидный фак­тор (РФ) - аутоантитела IgM, IgA и IgG классов, реагирующие с Fc-фрагментом IgG.

РФ - чувствительный, но недостаточно специфичный показатель, т. к. может обнаруживаться в сыворотках при других ревматических заболеваниях, хрониче­ских инфекциях, болезнях легких, злокачественных новообразованиях, первич­ном биллиарном циррозе и в пожилом возрасте.

Ревматоидный фак­тор IgM

Наибольшее значение в кли­нической практике имеет определение IgM РФ. Положительные результаты определения IgM РФ в сыворотке крови служат диагностическим критерием РА.

  • Диагностическая чувствительность теста составляет 50-90%;
  • диагностиче­ская специфичность - 80-93%;
  • предсказательная ценность положительных ре­зультатов (ПЦПР) - 24-84%;
  • предсказательная ценность отрицательных резуль­татов (ПЦОР) - 75,2-89%.

Следует отметить, что значения специфичности и чувствительности данного теста могут варьировать в зависимости от выбранной точки разделения между границами нормы и патологии ("cut-off") (табл. 3).

По последним данным, с целью повышения диагностической специфичности данно­го маркера, рекомендуется использовать "cut-off" 50 МЕ/мл. Выявление IgM РФ в высоких титрах позволяет прогнозировать быстропрогрессирующее де­структивное поражение суставов и развитие внесуставных проявлений при РА.

В то же время определение IgM РФ не имеет доказанного значения для оценки эффективности проводимой терапии. При интерпретации результатов определе­ния IgM РФ для диагностики РА необходимо учитывать существование серонегативных при определении РФ вариантов данного заболевания. Серонегативный РА чаще встречается у женщин и больных с дебютом РА в пожилом возрасте, чем у мужчин и лиц с началом заболевания в среднем возрасте.

Ревматоидный фак­тор IgА

IgA РФ часто обнаруживается при РА с полиартикулярным вариантом на­чала заболевания и внесуставными (системными) проявлениями, при IgA-нефропатии, синдроме Шегрена, пурпуре Шенлейна - Геноха и инфекционном эндокардите. Выявление IgA РФ может обладать определенной прогностиче­ской ценностью в отношении развития тяжелой деструкции суставов. IgG РФ определяется при различных заболеваниях человека, и в настоящее время его клиническое значение до конца не ясно.

Ревматоидный фак­тор IgG

Стандартными методами определения РФ являются реакция агглютинации сенсибилизированных IgG частиц латекса (латекс-тест) или эритроцитов барана (реакция Валер - Розе), нефелометрия и метод иммуноферментного анализа (ИФА).

Антитела к циклическому цитруллинированному пептиду (АЦЦП) 

На сегодняшний день накоплено большое количество данных, позволяю­щих считать антитела к циклическому цитруллинированному пептиду (АЦЦП) наиболее диагностически эффективным маркером РА.

Разработка диагностиче­ских наборов с использованием синтетического цитруллинированного пептида второго поколения (АЦЦП2) позволила довести чувствительность метода до сравнимой с РФ - 49-91%, а специфичность сохранить на прежнем уровне - бо­лее 98% (ПЦПР - 87,5%; ПЦОР - 86,5%) (табл. 4).

Диагностический потенциал АЦЦП2 подтверждается их выявлением у 34-69,3% серонегативных по РФ па­циентов с РА. АЦЦП имеют большое значение как прогностический маркер тя­жести течения РА. ПЦПР и ПЦОР данных антител для прогнозирования тяже­лого эрозивного поражения суставов, по данным различных авторов, составляют 63-88 и 58-90% соответственно.

Создан, но пока не получил широкого распространения набор для ИФА третьего поколения - АЦЦП3 и его модификация АЦЦП31 позволяющие опре­делять одновременно антитела и IgG изотипов. Согласно данным зарубеж­ных авторов, эти тест-системы демонстрируют чувствительность, сравнимую с АЦЦП2, уступая при этом в специфичности (табл. 5).

Необходимо учитывать, что в настоящее время не существует стандартизо­ванной на международном уровне методики определения АЦЦП. Для проведе­ния исследований применяются методы, основанные на ИФА и имунохемилю-минисценции, обладающие различной диагностической точностью, которая, в свою очередь, зависит от используемого антигена, реагентов и выбранного про­изводителем значения "cut-off" (табл. 6) [6].

Таким образом, определение АЦЦП может быть очень полезно для диагностики:

  • раннего РА;
  • серонегативного РА;
  • дифференциальной диагностики РА с другими ревматическими заболеваниями и прогнозирования тяжелого эрозивного поражения суставов.

Совместное определение РФ и АЦЦП позволяет осуществлять диагностику РА на ранних стадиях, что важно для своевременного назначения более агрессивной базис­ной противоревматической терапии.

Антитела к модифици­рованному цитруллинированному виментину (АМЦВ) 

Все большее распространение получает определение антител к модифици­рованному цитруллинированному виментину (АМЦВ) методом ИФА.

Литера­турные источники указывают на достаточно высокую чувствительность, специ­фичность и диагностическую эффективность определения АМЦВ для диагностики РА [9] (табл. 7).

Важно отметить, что данные параметры могут ва­рьировать в зависимости от выбора "cut-off" (табл. 8).

При раннем РА АМЦВ проявляют меньшую специфичность, чем при развернутом РА, демонстрируя сходную чувствительность (табл. 9).

  • ПЦПР составляет 90%;
  • ПЦОР - 65%;
  • AUC -0,7.

Определение АМЦВ является высокочувствительным серологическим те­стом:

  1. для ранней диагностики РА;
  2. дифференциальной диагностики РА с други­ми ревматическими заболеваниями;
  3. предиктором неблагоприятного рентгенологического прогноза суставной деструкции.

Однако требуются до­полнительные исследования специфичности данного теста и определение опти­мальной границы нормального содержания АМЦВ в сыворотке крови. Важно отметить, что наибольшую диагностическую ценность имеет совместное опре­деление РФ, АЦЦП и АМЦВ.

Антитела к цитруллинированному фибриногену (АЦФ) обладают сходны­ми с АЦЦП2 основными диагностическими параметрами (табл. 10).

Выявление АЦФ может быть полезным для постановки диагноза РА, в частности у пациен­тов, негативных по РФ; повышение концентрации АЦФ является определенным предиктором радиологической прогрессии при РА.

Острофазовый ответ

Воспаление является физиологической защитной реакцией организма в от­вет на тканевое повреждение. Его основу составляет каскад биохимических и иммунологических процессов, направленных на элиминацию повреждающего фактора, заживление и восстановление нарушенных функций тканей и органов.

Воспаление может носить:

  • как острый;
  • так и хронический характер [12].

При РА процесс системного хронического воспаления сопровождается:

  1. повышением скорости оседания эритроцитов (СОЭ);
  2. концентрацией таких острофазовых белков, как:
  • С-реактивный белок (СРБ);
  • сывороточный амилоидный белок А (САА);
  • фибриноген;
  • матричная металлопротеиназа 3 (ММП3) (табл. 11).

Повышение скорости оседания эритроцитов (СОЭ)

СОЭ - высокочувствительный, но неспецифичный маркер системного вос­паления. Ее определение может быть полезным для мониторирования течения РА, однако увеличение СОЭ не всегда коррелирует с активностью заболевания. Для проведения исследования рекомендуется международный метод определе­ния СОЭ по Вестергрену как обладающий наибольшей чувствительностью. Верхняя граница СОЭ в норме по Вестергрену зависит от возраста и пола паци­ента и рассчитывается по формулам: для женщин - СОЭ (мм/ч) = (возраст в годах + 10)/2; для мужчин - СОЭ (мм/ч) = (возраст в годах)/2 .

С-реактивный белок (СРБ)

СРБ - классический острофазовый белок плазмы крови, рассматриваю­щийся как наиболее чувствительный лабораторный маркер инфекции, воспале­ния и тканевого повреждения.

Определение СРБ является полезным тестом для оценки активности пато­логического процесса, прогноза тяжести деструктивного поражения суставов у больных с РА и дифференциальной диагностики РА и системной красной вол­чанки. Показано, что использование именно СРБ, а не СОЭ при подсчете DAS28 позволяет более достоверно оценить активность заболевания.

Определение базального уровня СРБ высокочувствительным методом (вчСРБ) имеет важное значение для стратификации больных РА по степени кардиоваскулярного ри­ска. Базальная концентрация вчСРБ менее 1 мг/л соответствует низкому, 1-3 мг/л - среднему, более 3 мг/л - высокому кардиоваскулярному риску. Уро­вень вчСРБ от 3 до 10 мг/л ассоциируется с субклиническим "low grade" воспа­лением, а более 10 мг/л - с системным персистирующим "high grade" воспалени­ем и еще более высоким кардиоваскулярным риском.

Сывороточный амилоидный белок А (САА);

САА является предшественником амилоидного белка А. При воспалитель­ном ответе его уровень может повышаться более чем в 1000 раз. В ряде публи­каций показано, что САА может отражать острое воспаление лучше, чем СРБ, уровень которого не повышается при вирусной инфекции, отторжении транс­плантата и изменении доз принимаемых глюкокортикоидов. Имеются данные, что САА является более чувствительным показателем активности РА, чем СРБ. Возможно, повышенная концентрация САА является предиктором развития вторичного амилоидоза у больных РА. Примерные значения нормального со­держания САА в сыворотке составляют 5-30 мг/л.

Фибриноген

Фибриноген (фактор I) - белок, синтезирующийся в основном в печени. При РА повышение уровня фибриногена связано с активностью заболевания, содержанием фибрина в синовиальной жидкости и степенью выраженности его локальных внутрисуставных отложений. Нормальный уровень фибриноге­на в периферической крови составляет 2-4 г/л.

Матричная металлопротеиназа 3 (ММП3)

ИммуноблоттингММП3 - фермент, ответственный за деградацию многих компонентов экстра-целлюларного матрикса, при РА его высокая концентрация обнаруживается как в синовиальной жидкости, так и в периферической крови. Уровень МПП3 коррели­рует с активностью заболевания, рентгенологическими проявлениями, СОЭ и кон­центрацией СРБ. Необходимо учитывать, что повышение ММП3 не является спец­ифичным для РА, т. к. наблюдается и при других ревматических заболеваниях, например при реактивном и подагрическом артритах. Обсуждается роль ММП3 как показателя, позволяющего мониторировать эффективность лечения РА.

Одним из перспективных подходов в иммунологической диагностике являет­ся исследование индивидуального профиля аутоантител. Принципиально новый уровень лабораторных исследований, позволяющих осуществить эту задачу, обе­спечивается применением микрочиповых технологий. Использование микрочи­пов позволяет проводить одновременное многопараметровое тестирование сотен образцов не только для обнаружения аутоантител, но и для определения профиля острофазового воспалительного ответа, включающего белки острой фазы и про­тивовоспалительные цитокины. Создание таких современных технологий, как двухмерный электрофорез, масс-спектрометрия, мультиплексный анализ и про­точная цитофлуорометрия, делает возможным поиск новых биомаркеров, задей­ствованных в патогенезе РА, и выделение показателей, имеющих наибольшее диа­гностическое и прогностическое значение для данного заболевания.

Таблица 1

Аутоантитела, выявляемые при ревматоидном артрите

Маркер

Чувстви­тель­ность, %

Специ-

фич-ность, %

Метод определения

Норма

РФ (IgM)

50-90

80-93

Латекс-тест Ваалер - Розе тест

Нефелометрия

ИФА**

1 : 40

Отсутствие агглютинации

0-15 Ме/мл 0-20 Ме/мл

Антитела к цитруллинированным белкам

Антиперинукле-арный фактор*

40-91

92-99

НРИФ***

<1 : 80

Антикератиновые

48,6

95-97

НРИФ

<1 : 10 (Immco Diagnostics)

антитела*

Антифилаггрино-вые антитела*

50-67,1

68-98

Иммуноблоттинг ИФА

abs

Стандартиз ов анный метод осутствует

Антитела к цикли-

49-91

73-99

ИФА

0-5 Ед/мл (Axis-Shield,

ческому цитрул-линированному пептиду*

Euroimmun) 0-6,25 Ед/мл (Genesis) 0-20 Ед/мл (Inova) 0-25 Ед/мл (Euro-Diagnostica)

Антитела к ци-

20-75

95

ИФА

0-20 Ед/мл (Orgentec)

труллинированно-

му виментину*

Антитела к ци-

59-80

95-99

ИФА

Стандартизованный

труллинированно-му фибриногену*

метод отсутствует

Другие аутоантитела

Антитела к RA33

30

90

НРИФ

Иммуно блотинг

abs

Антитела к BiP

60

96

ИФА

Стандартиз ов анный метод отсутствует

Антитела к калпа-

31-57

63-71

ИФА

Стандартиз ов анный

статину

метод отсутствует

Антитела к

24,8

97,2

Иммуно блотинг

abs

а-энолазе

* Специфические маркеры РА. ** ИФА - иммуноферментный анализ. *** НРИФ - непрямая иммунофлуоресценция.

Таблица 2

Частота обнаружения IgM РФ при различных заболеваниях человека

Заболевания

Частота, %

  • Ревматоидный артрит

50-90

  • Системная красная волчанка

15-35

  • Синдром Шегрена

75-95

  • Системная склеродермия

20-30

  • Полимиозит/дерматомиозит

<10

  • Криогло булинемия

40-100

  • Смешанное заболевание соединительной ткани

50-60

Инфекции:

  • бактериальный эндокардит

25-50

  • туберкулез

<10

  • сифилис

<13

  • паразитарные инфекции

20-90

  • проказа

5-58

  • вирусные инфекции (краснуха, корь, грипп)

15-65

Болезни легких:

  • саркоидоз

3-33

  • интерстициальный легочный фиброз

10-50

  • силикоз

30-50

  • асбестоз

30

  • Первичный билиарный цирроз

45-70

Злокачественые новообразования:

  • солидные

5-25

  • лимфопролиферативные

до 50

Здоровые люди:

  • моложе 70 лет

<5

  • старше 70 лет

до 25*

* Имеются данные о том, что частота обнаружения и титры РФ не увеличиваются с возрастом.

Таблица 3

Чувствительность и специфичность IgM РФ в зависимости от значения "cut-off"

Диагноз

"Cut-off" = = 15 МЕ/мл

"Cut-off" = = 50 МЕ/мл

"Cut-off" = = 100 МЕ/мл

1

2

3

4

Ревматоидный артрит

>60

35-60

10-35

Синдром Шегрена

>60

35-60

10-35

Системная красная волчанка

10-35

10-35

<10

Смешанное заболевание со­единительной ткани

10-35

10-35

<10

Системная склеродермия

35-60

10-35

<10

Полимиозит/дерматомиозит

<10

0

0

Реактивный артрит

0

0

0

Остеоартроз

10-35

<10

<10

Здоровые лица

<10

0

0

Чувствительность, %

66

46

26

Специфичность, %

72

88-92

95-98

Границы степеней позитив­ности

Низко позитив­ные значения: 15-50 МЕ/мл

Умеренно пози­тивные значения: 50-100 МЕ/мл

Высоко позитив­ные значения: >100 МЕ/мл

Таблица 4

Диагностическая чувствительность и специфичность АЦЦП и РФ при РА

РА

Др.

РЗ,

кол-во

Пока­затель

Кол-во

Возраст, лет

Длитель­ность забо­левания,

Здоро­вые лица

Чувстви­тельность,

%

Специфич­ность, %

лет

АЦЦП1

2234

55 (±7)* 54 (46-65)**

1,5 (±1)* 1,3 (0,3-3)**

324

1465

53(±10)* 54(41-68)**

96(±3)* 97(90-99)**

АЦЦП2

6125

55 (±5)* 55 (46-66)**

5 (±4,5)*

4 (0,2-14,5)**

1561

4646

68(±15)** 68,5(39-94)**

95(±5)* 97(81-100)**

РФ

8206

55,5 (±6)* 55 (46-66)**

4 (±4)*

2 (0,2-15)**

1865

5797

60(±18)* 65(25-95)**

79(±15)* 81(31-95)**

* Результаты представлены в виде среднего значения (± стандартное отклонение). ** Результаты представлены в виде медианы и интерквартильного размаха.

Таблица 5

Чувствительность, специфичность и диагностическая эффективность* определения АЦЦП второго и третьего поколений при РА

Тест

Чувствительность, %

Специфичность, %

AUC

АЦЦП2

49-91

73-99

0,710-0,903

АЦЦП3

77,3-78,8

87,8-96,6

0,911

АЦЦП3,

83-85,7

89,8-98,3

0,945

* Диагностическая эффективность рассчитана при помощи ROC-анализа и представлена в виде пло­щади под кривой (AUC-Аrea Under Curve).

Таблица 6

Чувствительность и специфичность определения АЦЦП при использовании различных коммерческих тест-систем для ИФА

Производитель

Cut-off

Чувствительность, %

Специфичность, %

Genesis (АЦЦП2)

6,25 (Ед/мл)

69,6

93,9

Euro-Diagnostica (АЦЦП2)

25 (Ед/мл)

76,5

95,4

Euroimmun (АЦЦП2)

5 (усл. Ед/мл)

72,5

96,4

Axis-Shield (АЦЦП2)

5 (Ед/мл)

82

90

Inova (АЦЦП3)

20 (Ед)

77,5

87,8

Таблица 7

Чувствительность, специфичность и диагностическая эффективность определения АМЦВ*

Тест

Чувствительность, %

Специфичность, %

AUC

АМЦВ

69,5-82

90,8-97

0,824

АЦЦП2

49-91

73-99

0,710-0,903

АЦЦП3

77,3-78,8

87,8-96,6

0,911

* Диагностическая эффективность рассчитана при помощи ROC-анализа и представлена в виде пло­щади под кривой (AUC).

Таблица 8

Чувствительность и специфичность определения АМЦВ при РА в зависимости от "cut-off"

"Cut-off"*, Ед/мл

Чувствительность, %

Специфичность, %

20

69,5

90,8

19*

70,1

89,8

81,5*

53,7

98,7

* При определении оптимального "cut-off" использовался ROC-анализ.

Таблица 9

Чувствительность и специфичность определения АМЦВ при раннем РА в зависимости от "cut-off"

"Cut-off"*, Ед/мл

Чувствительность, %

Специфичность, %

20

67

71

20*

63

75

30*

57

88

* При определении оптимального "cut-off" использовался ROC-анализ.

Таблица 10

Чувствительность, специфичность и диагностическая эффективность определения АЦФ*

Тест

Чувствительность, %

Специфичность, %

AUC

АЦФ

59-80

95-99

0,82-0,89

* Диагностическая эффективность рассчитана при помощи ROC-анализа и представлена в виде пло­щади под кривой (AUC).

Таблица 11

Маркеры острой фазы воспаления при РА

Маркер

Метод определения

Норма

СРБ

Радиальная иммунодиффузия Турбодиметрия Нефелометрия ИФА

0-5 мг/л

САА

5-30 мг/л

Фибриноген

Нефелометрия Коагулологический тест

2-4 г/л

ММП3

ИФА

Муж. -0-60 нг/мл Жен. -0-20 нг/мл

Авторы:

  1. Е.Н. Александрова, д-р мед. наук, заведующая лабораторией,
  2. А.А. Новиков, канд. биол. наук, ведущ. науч. сотр. лаборатории Лаборатория иммунологии и молекулярной биологии ревматических заболеваний НИИР РАМН


Подписка на статьи

Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Живое общение с редакцией

А еще...

Критерии качества 2017: готовимся к оценке по-новому

Интервью

ФФОМС Наталья Стадченко

Председатель ФФОМС Наталья Стадченко в интервью журналу «Здравоохранение»:

Для медработника страховой представитель – это и контролер, и юридический консультант, и помощник одновременно





Наши продукты




















© МЦФЭР, 2006 – 2017. Все права защищены.

Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
Свидетельство о регистрации средства массовой информации Эл № ФС77-38302 от 30.11.2009


  • Мы в соцсетях
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль