Применение жидкостной системы приготовления цитопрепаратов в цитологических и иммуноцитохимических исследованиях

2594

Необходимыми условиями для точной оценки морфологии клеток при цитоло­гическом и иммуноцитохимическом (ИЦХ) исследованиях являются высокое качество и адекватность мазка. При этом качество цитологической диагностики зависит от многих факторов: получения, фиксации и окрашивания, методики просмотра материала; опыта цитолога; использования дополнительных, совре­менных методов исследования. В настоящее время традиционное ци­тологическое исследование ассоциируется с относительно высоким уровнем ложноотрицательных и ложноположительных результатов. Попытки избежать подобных ошибок привели к разработке новых технологий, которые нацелены на улучшение качества цитопрепаратов, повышение чувствительно­сти исследований и продуктивности лабораторий.

Впервые новая технология приготовления цитопрепаратов - с использова­нием жидкостной системы была предложена в 1998 г. в США (ThinPrep, AutoCyte Prep). Суть метода заключается в том, что материал, полученный из шейки мат­ки посредством щеточки или шпателя, не переносится на стекло, а смывается в подготовленный стабилизирующий раствор и направляется в лабораторию, где при помощи специального оборудования выполняется приготовление тонко­слойного цитологического препарата высокого качества. Равномерное распре­деление материала на предметном стекле снижает количество ложноотрицательных результатов при цитологическом исследовании.

Тонкослойные цитопрепараты позволяют использовать современные мето­ды автоматизированного скрининга и компьютерные технологии, а также про­водить молекулярно-биологические исследования. Исследовате­ли отмечают, что тонкослойные цитопрепараты экономичнее в работе и более информативны, чем рутинные мазки, и рекомендуют использовать ThinPrep метод как в цитологической, так и ИЦХ диагностике.

Автором проведена оценка преимущества жидкостной системы приготов­ления цитопрепаратов в сравнении с обычными рутинными мазками при про­ведении цитологического и ИЦХ исследований.

Была применена отечественная жидкостная среда - питательная среда на­копления (ПСН) (заявка № 2003113164/15 от 05.05.03, патент на изобретение № 2246110 "Питательная среда накопления образца клеток для последующего цитологического и/или иммуноцитохимического анализа", решение о выдаче от 19.05.2004). Тонкослойные препараты были получены с помощью цитоцентрифуги Сytospin-3 (фирма Shandon).

ИЦХ исследования проводились 30 пациенткам с раком молочной железы. Использовались антитела к белку пролиферативной активности Ki-67 (DAKO), положительная реакция определялась в ядрах пролиферирующих клеток опу­холи. Выполнено 120 ИЦХ исследований: на тонкослойных мазках, приготов­ленных с использованием жидкостного метода, - 90, на мазках, приготовленных обычным рутинным способом, - 30. Изучались не только влияние ПСН на каче­ство цитопрепаратов и ИЦХ реакции, но и роль фактора времени, поскольку данная среда не обладает фиксирующими свойствами, а является именно пита­тельной. Для решения вопроса, как долго клетки рака могут находиться в такой среде, не изменяя при этом своих морфологических, биохимических и иммун­ных свойств, был выбран белок Ki-67 - период его полураспада составляет 60­90 мин.

Результаты исследований показали, что морфологических изменений в строении раковых клеток, их структурных образованиях после пребывания в ПСН в течение 48 ч не наблюдалось, что подтвердил параллельный цитологиче­ский анализ рутинных мазков у этих же больных. Все цитоспиновые препараты (100%) отличались высоким качеством полученных мазков: клетки располага­лись в монослое, локально в одном месте - "окошке", сохранялись клеточные структуры, фон из элементов крови и некроза выглядел скудным, монослойным и не примешивался к отдельно лежащим опухолевым клеткам. Надо отметить, что в 10% (3 наблюдения) исследований тонкослойных мазков клеточность была низкой, количество опухолевых элементов на мини-мазке не превышало 50-80 клеток на одном стекле, что не зависело от ПСН. Количественный ИЦХ анализ экспрессии белка Ki-67 осуществлялся за счет совокупности подсчета значений на нескольких (4) цитопрепаратах.

При анализе рутинных цитологических мазков удовлетворительное каче­ство отмечалось в 76,7% (23 наблюдения) исследований. В 23,3% (7 наблюдений) качество препаратов признано неудовлетворительным: клеточный материал был скуден (10%) и "разбросан" по всему периметру стекла, что увеличивало время просмотра мазка, или, наоборот, представлен в виде обильных, нагро­мождающихся друг на друга скоплений, густо перемешанных с элементами кро­ви и/или некротическими массами (13,3%). Надо отметить, что если для цито­логического исследования подобное качество мазков еще допустимо, то для ИЦХ исследования количественного анализа экспрессии ядерных маркеров это неприемлемо. В связи с чем преимущества в качестве цитоспиновых мазков не вызывают сомнений.

Помимо цитологического анализа была проведена серия ИЦХ исследова­ний экспрессии протеина Ki-67 на рутинных и тонкослойных цитопрепаратах от одних и тех же больных. Цитоспиновые препараты готовились из получен­ной взвеси (среды и клеточного материала) в разные временные промежутки: через 1, 3 и 24 ч нахождения в ПСН, после чего сразу проводилось ИЦХ иссле­дование с антителами к белку Ki-67 (таблица).

Временные интервалы иммуноцитохимических исследований экспрессии белка
Ki-67 на цитоспиновых препаратах

Время проведе­ния ИЦХ иссле­дования после пункции

Время нахож­дения пунктата в среде на­копления

Жидкостная система приго­товления цитопрепаратов

Стандартный способ приго­товления мазков

Через 1 ч (1-я группа)

Не менее 1ч

93,4% совпадение ИЦХ резуль­татов с рутинным способом приготовления мазков

Проведено ИЦХ исследование

Через 3 ч (2-я группа)

Не менее 3 ч

100% совпадение ИЦХ резуль­татов с 1-й группой

Не проводилось

Через 24 ч (3-я группа)

Не менее 24 ч

100% совпадение ИЦХ резуль­татов с 1-й и 2-й группами

Не проводилось

Анализ полученных результатов показал, что в 1-й группе исследований (ее составили 30 ИЦХ исследований, проведенных через 1 ч после пункции) экс­прессия белка Ki-67 на цитоспиновых и обычных препаратах совпала в 93,4% случаев: в 2 мазках (6,6%), приготовленных обычным способом, оценить ре­зультат, а значит, и сопоставить, не представлялось возможным, т. к. в первом наблюдении клеточный материал был крайне скудным, представлен нескольки­ми плотными скоплениями раковых клеток на фоне бесструктурных некроти­ческих масс (на цитоспиновом препарате экспрессия белка Ki-67 наблюдалась в 20% клеток), во втором - мазок был густой, обильно перемешанный с элемента­ми крови (на цитоспиновом препарате экспрессия белка Ki-67 наблюдалась в 35% клеток), ИЦХ реакции на этих двух рутинных мазках не просматривались. Положительная экспрессия белка Ki-67 наблюдалась на цитоспиновых препара­тах в 80,0% исследований (24 наблюдения), по степени выраженности распреде­лилась следующим образом: слабая - 37,5% (9), умеренная - 50% (12), выражен­ная - 12,5% (3).

ИЦХ реакции, проведенные на обычных мазках, по степени выраженно­сти полностью совпадали с результатами ИЦХ исследования на цитоспиновых препаратах, но требовали большего времени просмотра из-за плохого ка­чества мазков и неравномерного распределения клеточного материала на стекле, а также большого расхода реактивов: на один цитоспиновый препарат расходовалось 50 мкл разведенных антител, тогда как на обычный мазок - 300-400 мкл.

Вторую группу (30 наблюдений) составили ИЦХ исследования на цитоспиновых препаратах, приготовленных через 3 ч после пребывания клеток опухоли в ПСН. Анализ полученных данных показал, что результаты ИЦХ исследований на цитоспиновых мазках 1-й группы полностью совпали с результатами ИЦХ исследований на препаратах 2-й группы. Положительная экспрессия белка Ki-67 также отмечалась в 80,0% исследований (24 наблюдения) и по степени выра­женности распределилась следующим образом: слабая - 37,5% (9), умеренная -50% (12), выраженная - 12,5% (3).

ИЦХ исследования в 3-й группе (30 наблюдений) проводились через сутки (клетки опухоли находились в ПСН не менее 24 ч при 8 °С), также только на цитоспиновых мазках. Сопоставление полученных результатов ИЦХ исследо­ваний показало, что пребывание клеток рака в питательной среде не влияет на их иммуноспецифические свойства, кроме того, не активизирует и не снижает пролиферативную активность опухолевых клеток, а всего лишь стабилизирует ее. Результаты ИЦХ исследований полностью совпали с данными, полученными в 1-й и 2-й группах.

Таким образом, применение метода жидкостной цитологии при цитологи­ческом и ИЦХ исследованиях имеет ряд преимуществ перед рутинным спосо­бом приготовления цитопрепаратов:

  • позволяет получить монослой клеток, обеспечивая сохранность клеточных структур;
  • уменьшает фон, позволяет избежать "загрязнения" опухолевых клеток эле­ментами крови и воспаления, облегчая просмотр цитологических препаратов; ~ сокращает время просмотра мазка;
  • позволяет использовать современные компьютерные технологии обработ­ки изображений, проведения морфометрии, иммуноморфологических ис­следований;
  • уменьшает практически в 6-8 раз расход дорогостоящих реактивов, что особенно важно при ИЦХ и молекулярно-биологических исследованиях.

М.В. Савостикова,
канд. мед. наук, науч. сотр. Отделения онкоцитологии МНИОИ им. П.А. Герцена



Подписка на статьи

Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Живое общение с редакцией

А еще...

Критерии качества 2017: готовимся к оценке по-новому

Интервью

ФФОМС Наталья Стадченко

Председатель ФФОМС Наталья Стадченко в интервью журналу «Здравоохранение»:

Для медработника страховой представитель – это и контролер, и юридический консультант, и помощник одновременно





Наши продукты




















© МЦФЭР, 2006 – 2017. Все права защищены.

Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
Свидетельство о регистрации средства массовой информации Эл № ФС77-38302 от 30.11.2009


  • Мы в соцсетях
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль