Стандартизация протоколов цитогенетического исследования при острых лейкозах, миелопролиферативных заболеваниях и миелодиспластических синдромах

8345
Стандартизация протоколов цитогенетического исследования при острых лейкозах, миелопролиферативных заболеваниях и миелодиспластических синдромах

Цитогенетическое исследование - стандартное кариотипирование, дополнен­ное методом флуоресцентной гибридизации in situ, в настоящее время является обязательным при постановке гематологического диагноза. Определение спе­цифических перестроек позволяет правильно выбрать протокол лечения, от­слеживать результаты терапии, вовремя начать поиск донора для транспланта­ции костного мозга.

Учитывая важность результатов цитогенетического исследования в повсе­дневной практике врача-гематолога, возросшее число цитогенетических лабо­раторий, участвующих в обследовании больных гемобластозами, возникает не­обходимость в разработке единых протоколов цитогенетического исследования при отдельных нозологических формах с указанием необходимого и достаточ­ного объема исследования. Очевидно, что такие протоколы будут подвергаться постоянным уточнениям по мере накопления новых данных и разработки но­вых программ терапии.

В европейских странах протоколы цитогенетического исследования опре­деляются центрами контроля качества генетических исследований и исследова­тельскими группами в рамках различных протоколов лечения. Европейским сообществом цитогенетиков, работающих с гематологическими клиниками (European Leukemia Net,), было предложено разработать единые протоколы цитогенетического исследования при гематологических за­болеваниях. В нашей стране объем необходимого и достаточного исследования определяется исследовательскими протоколами, разработанными ведущими учреждениями в области гематологии.

В связи с возросшей ролью методов стандартной и молекулярной цитогенетики в диагностике опухолей кроветворной системы представляется важным обсудить основные положения стандартов цитогенетического исследования при различных онкогематологических заболеваниях, предложенных Европей­ской группой по изучению лейкемии. В основу данных стандартов положены практические рекомендации Ассоциации клинических цитогенетиков Велико­британии (Association for Clinical Cytogenetics).

Так как различные гематологические заболевания требуют разных условий культивирования и характеризуются различными генетическими перестройка­ми, для выявления которых требуются различные ДНК-зонды, были предложе­ны отдельные протоколы для различных нозологических форм. В данной статье мы рассмотрим предложения по цитогенетическому и молекулярно-генетическому исследованию при остром лимфобластном лейкозе, остром миелобластном лейкозе, хроническом миелолейкозе, хронических миелопролиферативных заболеваниях и миелодиспластических синдромах. Также даны краткие реко­мендации по сбору образцов, культивированию и анализу результатов.

Получение материала, культивирование, анализ и оценка результатов

Оптимальное число клеток для культивирования составляет 1-3 млн в 1 мл среды. Для получения наилучших результатов рекомендовано брать 2-5 мл костного мозга или 5-10 мл крови в пробирку с гепарином. На практике у взрос­лых больных объем получаемого костного мозга составляет 1,5-3 мл, у детей объем получаемого костного мозга и крови значительно меньше. Для быстрой диагностики методом FISH следует сделать 3 мазка костного мозга. Костный мозг/кровь должны быть доставлены в лабораторию в течение 24 ч.

Для всех гематологических опухолей, за исключением хронического лимфолейкоза, исследование костного мозга предпочтительнее, чем перифериче­ской крови. При апластической анемии и миелодиспластическом синдроме без бластных клеток в периферической крови исследуется только костный мозг. Время экспозиции с колхицином/колцемидом и его концентрацию лаборато­рии, как правило, подбирают самостоятельно. Рекомендовано краткосрочное культивирование (24-48 ч) с добавлением колцемида на 0,5-2 ч, однако, по на­шему мнению, лучшие результаты достигаются при культивировании с добав­лением малых доз колхицина (колцемида) на ночь и использовании "прямых" проб. Также "прямые" пробы в дополнение к 24-часовым следует ставить при острых лейкозах, лимфомах, миелодиспластических синдромах у детей.

Для получения достоверных результатов необходимо кариотипировать по крайней мере 10-20 аномальных метафаз или 20-25 нормальных метафаз.

В анализе каждого образца должны принимать участие два сотрудника ла­боратории, один из которых является опытным сотрудником, имеющим серти­фикат специалиста.

При исследовании методом FISH анализируется 100-200 ядер. При обнару­жении однозначно позитивных клеток может быть проанализировано и мень­шее число клеток. При необходимости количество анализируемых клеток мо­жет быть увеличено. Для быстрой FISH-диагностики лимфом и солидных опухолей исследуют отпечатки опухоли или мазки костного мозга (при его ин­фильтрации). Это позволяет выбрать для анализа клетки определенной морфо­логии.

FISH-анализ также проводится по меньшей мере двумя исследователями, один из которых должен быть опытным сотрудником, имеющим сертификат специалиста.

Алгоритм цитогенетического исследования при различных заболеваниях

Острый лимфобластный лейкоз

Рекомендовано краткосрочное культивирование двух вариантов культур (24 и 48 ч). Для детей постановка прямой культуры, на наш взгляд, весьма жела­тельна. Для флуоресцентной in situ гибридизации предпочтительно использо­вать клетки из прямой культуры или мазки костного мозга.

Минимальным необходимым объемом исследования, проводимым при В-клеточном остром лимфобластном лейкозе у больных любого возраста, явля­ется стандартное кариотипирование и тестирование на наличие химерного гена BCR/ABL методом FISH или "real-time" ПЦР.

У детей при нормальном кариотипе или недостаточном качестве/количе­стве метафаз, или аномальном кариотипе с комплексными и неспецифически­ми перестройками желательно исследование методом FISH не только с ДНК-зондом к химерному гену BCR/ABL, но и с ДНК-зондом к химерному гену ETV6/ RANX(AML1) - для выявления острых лимфобластных лейкозов с транслока­цией t (12;21), имеющих хороший прогноз, однако пока не выделяемых в отдель­ный лечебный протокол. Кроме того, ДНК-зонд ETV6/RANX(AML1) позволяет обнаружить довольно редко встречающуюся аномалию - амплификацию гена AML1 - недавно обнаруженный маркер неблагоприятного прогноза, а также предположить наличие гиперплоидного кариотипа.

Выявление перестроек гена MLL методом FISH является дополнительным к кариотипированию и молекулярно-биологическому исследованию, т. к. опреде­ляющее значение для прогноза и выбора тактики лечения имеет определение гена-партнера, участвующего в перестройке.

При нормальном кариотипе или отсутствии митозов С. Haferlach и соавто­ры рекомендует у детей также применять набор из 4-7 центромерных проб (обычно 7, 4, 10, 17 и 5, 18, 14, 13 или Х на выбор) для выявления гипо- и гипер-плоидии. Так же поступают и при обследовании детей, страдающих острым миелобластным лейкозом, в рамках протокола лечения острых лимфобластных лейкозов Berlin-Frankfurt-Munster (BFM) Study Group. Однако такое исследова­ние является крайне дорогим и трудоемким и может быть проведено только в рамках специальной программы.

При Т-клеточных острых лимфобластных лейкозах значительная часть пе­рестроек имеет субмикроскопический характер. European Leukemia Net реко­мендовано применение проб для CDKN2A, SIL/TAL, NUP214/ABL1. Однако это также возможно лишь в специализированных лабораториях в рамках утверж­денных протоколов.

Наблюдение за остаточной болезнью при остром лимфобластном лейко­зе методом G-полос не проводится. В отдельных случаях показано исследование методом FISH. При Ph-позитивном остром лимфобластном лейкозе монито­ринг минимальной остаточной болезни целесообразно проводить методом "real-time" ПЦР.

При рецидиве заболевания достаточно проанализировать 10 метафаз, если обнаружена аномалия, выявленная в дебюте заболевания. При нормаль­ном кариотипе анализируется 30 метафаз. При поздних рецидивах следует учи­тывать высокую вероятность появления второй опухоли и при отсутствии диа­гностической перестройки, на наш взгляд, целесообразно исключить перестройки гена MLL и моносомию 7 (в зависимости от предшествующей те­рапии) как наиболее частые характеристики вторичных лейкозов.

Острый миелобластный лейкоз

Цитогенетическое исследование методом G-полос остается "золотым стан­дартом" в диагностике острого миелобластного лейкоза, т. к. хромосомные пе­рестройки выявляются в 85-95% случаев.

Исследуется костный мозг, в отдельных случаях допустимо исследование пе­риферической крови (при циркуляции бластных клеток). При аберрантном кариотипе анализируется 10-20 метафаз, при нормальном кариотипе - 20-25 метафаз.

Время культивирования составляет 24-48 ч. У детей желательна постанов­ка и прямой культуры. При промиелоцитарном лейкозе постановка 48-часовой культуры обязательна.

При подозрении на острый промиелоцитарный лейкоз и нормальном кариотипе или отсутствии митозов показано исследование с ДНК-зондом для вы­явления химерного гена PML/RARa. Во всех случаях предполагаемого, по дан­ным морфологического и цитохимического исследований, промиелоцитарного лейкоза следует направить материал для исследования методом FISH или "real­time" ПЦР в одну из специализированных лабораторий. При аномальной эозинофилии проводят исследование с ДНК-зондом для выявления inv(16)(p13;q22) или t(16;16)(p13;q22). При бифенотипическом варианте - исследование с ДНК-зондом к химерному гену BCR/ABL. При отсутствии морфологических особен­ностей и нормальном кариотипе или отсутствии митозов для своевременного выявления группы высокого риска следует провести исследование методом FISH с ДНК-зондами для выявления t(8;21)(q22;q22), перестроек гена MLL, моносомии 7, inv/t(3p21;3q26).

Исследование после индукционной терапии может быть полезным при рефрактерном течении заболевания и при невозможности провести молекулярно-биологическое исследование (например, при моносомиях и трисомиях). Це­лесообразно в этих случаях исследование методом FISH. В целом наблюдение за минимальной остаточной болезнью цитогенетическими методами не прово­дится.

В случае рецидива заболевания достаточно проанализировать 10 метафаз, если обнаружена аномалия, выявленная в дебюте заболевания. При нормаль­ном кариотипе анализируется 30 метафаз, при наличии возможности следует провести исследование методом FISH. При поздних рецидивах также следует учитывать высокую вероятность появления второй опухоли.

Миелодиспластические синдромы

При работе с миелодиспластическими синдромами помогает тесное сотруд­ничество с лечащим врачом и морфологами, что позволяет правильно выбрать ДНК-зонды для дополнительного исследования.

Материал для исследования - всегда костный мозг. Культивирование в те­чение 24 ч предпочтительнее (с колцемидом/колхицином на ночь или на 0,5-2 ч до фиксации). При обнаружении аномалии анализируется 10-20 метафаз, при нормальном кариотипе - 20-25. При обнаружении одной клетки с потерей хро­мосомы 7 количество анализируемых метафаз следует увеличить до 30.

При нормальном кариотипе или отсутствии митозов у взрослых желатель­но провести исследование методом FISH для выявления делеции хромосомы 5 (del(5q)), моносомии 7/del(7), трисомии 8. У детей - для выявления моносомии 7/del(7) и трисомии 8.

В случае апластической анемии исследование проводится по алгоритму исследования при миелодиспластическом синдроме.

Хронический миелолейкоз

Рекомендовано краткосрочное культивирование двух вариантов культур (24 и 48 ч). Как свидетельствует наш опыт, прямая проба и 24-часовое культиви­рование дают достаточное количество митозов. В момент первоначальной диа­гностики возможно исследование как клеток костного мозга, так и перифериче­ской крови, однако костный мозг в данном случае предпочтительнее. Для наблюдения за цитогенетическим ответом во время гематологической ремис­сии исследуется костный мозг.

FISH-анализ на интерфазных ядрах для выявления химерного гена BCR/ ABL выполняют во всех случаях, т. к. для мониторинга ответа на лечение мето­дом FISH необходимо знать картину распределения сигналов в дебюте заболе­вания. Случаи с образованием только одного слитного сигнала не подходят для мониторирования методом FISH. Желательно выполнять исследование всем больным с пробой не только к гену BCR/ABL, но и выявляющей делецию 9q34, одного из маркеров резистентности к терапии.

Для определения цитогенетического ответа на лечение основным методом остается стандартное цитогенетическое исследование 25-30 метафаз. При от­сутствии митозов анализируется 100-200 ядер методом FISH. В фазе акселера­ции и бластного криза анализируют 20-25 метафаз, сконцентрировав внимание на поиске дополнительных перестроек.

Для диагностики других миелопролиферативных заболеваний применяют стандартное кариотипирование. Методом FISH или "real-time" ПЦР исключают образование химерного гена BCR/ABL и перестройки гена PDGFRB. Обязатель­но молекулярно-биологическое исследование для выявления мутаций гена JAK2.

При гиперэозинофильном синдроме помимо кариотипирования выпол­няют FISH-анализ для выявления перестроек генов PDGFRA и FIP1L1.

Стандартное цитогенетическое исследование по возможности должно про­водиться всем больным гематологическими заболеваниями. На какой из моле­кулярных методов детекции основных диагностических транслокаций - FISH или "real-time" ПЦР - опираться при диагностике, зависит от возможностей и задач клиники. Стремительно развивающиеся молекулярно-биологические ме­тоды ("real-time" ПЦР, microarrays), позволяющие быстро выявить специфиче­ские транслокации и pяд прогностически важных генетических изменений, ко­торые невозможно обнаружить цитогенетическими методами (мутации генов NPM1 и FLT3 при остром миелобластном лейкозе, JAK2 при хронических миелопролиферативных заболеваниях, IgVH статус при хроническом лимфолейкозе), несомненно, несут важную диагностическую информацию, однако по-преж­нему не могут заменить стандартное кариотипирование.

Ю.В. Ольшанская,канд. мед. наук, зав. лабораторией цитогенетики и молекулярной генетики
ФГУ "Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии"

Читайте в ближайших номерах журнала «Справочник заведующего КДЛ»
    Читать >>


    Ваша персональная подборка

      Подписка на статьи

      Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

      Рекомендации по теме

      Мероприятия

      Мероприятия

      Повышаем квалификацию

      Посмотреть

      Самое выгодное предложение

      Самое выгодное предложение

      Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

      Живое общение с редакцией

      А еще...








      Наши продукты






















      © МЦФЭР, 2006 – 2017. Все права защищены.

      Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

      Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
      Свидетельство о регистрации средства массовой информации ПИ № ФС77-64203 от 31.12.2015.

      Политика обработки персональных данных

      
      • Мы в соцсетях
      Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×