text

🎁 Журнал+чайник в ПОДАРОК! УСПЕТЬ ➤➤➤

Здравоохранение

Применение иммуноблота в диагностике сифилиса

  • 1 декабря 2010
  • 8888
Применение иммуноблота в диагностике сифилиса

В настоящее время перед специалистами лабораторной службы стоят новые задачи по повышению надежности и репрезентативности методов диагности­ки и лечения инфекционных заболеваний, среди которых важное место зани­мает сифилис. Во многом их решение зависит от уровня информативности применяемых методов исследования и расширения диагностических возмож­ностей.

Внедрение в практику иммуноферментного анализа (ИФА) вместо реакции Вассермана значительно повысило качество лабораторной диагностики сифилиса. Существенным преимуществом данного метода является возможность авто­матизации процесса исследования, что позволяет снизить влияние человеческого фактора. Вместе с тем продолжается поиск методических подходов к диагностике раннего сифилиса, разработка новых панелей сыворотки с нормированным содержанием диагностически значимых белков Treponema pallidum и внедре­ние в практику подтверждающих тестов.

Внимание! Для скачивания доступна новая книга:  «Молекулярно-биологические исследования» ,

Однако по-прежнему положительные серологические реакции на сифилис, в т. ч. на серорезистентность, являются проблемой для врачей и пациентов. Проблема достоверности положительных результатов исследований име­ет важное значение и для скрининга донорской крови.

Появление на российском рынке зарегистрированных в установленном по­рядке и разрешенных к применению наборов реагентов для определения антител классов и IgG к отдельным антигенам Treponema pallidum методом иммуно­блота (вестерн-блота - western blot) значительно расширило возможности вери­фикации лабораторного (а на его основе - клинического и эпидемиологического) диагноза сифилиса. Стандартизации и повышению качества работы серологиче­ских лабораторий в последние годы уделяется большое внимание. Совершенство­ванию лабораторной диагностики сифилиса посвящено немало работ, в т. ч. имеется и определенный опыт применения иммуноблота.

Все вышесказанное обосновывает целесообразность включения в алгоритм лабораторной диагностики сифилиса подтверждающего теста - иммуноблота (при положительном либо сомнительном результате тестирования крови мето­дом ИФА). Данная система скрининга крови (первичная постановка (ИФА) по­вторная постановка (ИФА) для исключения внутрилабораторной ошибки с ис­пользованием тест-систем более высокой специфичности иммуноблот), которая в течение 20 лет используется в лабораторной службе диагностики ВИЧ-инфек­ции, может быть относительно быстро и с минимальными финансовыми вложе­ниями внедрена в работу серологических лабораторий для диагностики сифилиса.

Учитывая результаты исследований, проведенных нашими соотечествен­никами и зарубежными коллегами, по применению иммуноблота и обобщив собственный (с 2006 г.) опыт, предлагаю свой взгляд на про­блему серологической диагностики данного заболевания и возможность ис­пользования иммуноблота (предназначен для точной идентификации патоген-специфических антител) в качестве подтверждающего метода.

Для лабораторной службы первоочередной задачей является получение до­стоверного результата исследования биоматериала (крови, ликвора), что в усло­виях развития медицины (государственной и негосударственной) и системы медицинского страхования возможно при стандартизации лабораторных ис­следований. Стандартизация достигается следующим путем:

  • стандартизация преаналитического этапа исследования - как за пределами лаборатории (использование закрытых систем взятия крови и игл-"бабочек", что значительно снижает частоту гемолиза; забор крови в пластиковые пробирки однократного применения; соблюдение сроков хранения и до­ставки проб), так и в самой лаборатории;
  • проведение процедуры анализа образца биоматериала в соответствии с ин­струкцией;
  • использование средств измерений, прошедших метрологический контроль;
  • повторное исследование образцов крови с использованием применяемого метода (например, ИФА) либо иного метода, обладающего более высокой специфичностью (например, в реакции пассивной агглютинации желати­новых частиц, сенсибилизированных очищенными антигенами Tr. pallidum), и (или) иммуноблота в его модификациях для раздельного определения специфических антител классов IgM и IgG к наиболее значимым белкам возбудителя сифилиса;
  • правильная оценка результатов на постаналитическом этапе, их внесение в журнал и бланк результата анализа.

Последний этап является весьма ответственным в деятельности врача ла­боратории, учитывая возможность причинения пациенту морального ущерба при информировании о положительном результате тестирования крови на си­филис, если в последующем он признается ложноположительным. Несмотря на относительно высокую стоимость анализов при проведении ИФА и иммуноблота, использование комплекса лабораторных тестов вполне оправданно, т. к. этиологическая расшифровка определяет правомочность диагноза и принци­пиально влияет на тактику ведения пациента.

Причины получения ложноположительных результатов хорошо известны и подразделяются на две группы: не зависящие от лаборатории и зависящие от лаборатории.

Наиболее частой причиной недостоверного результата в лаборатории явля­ется повторное использование наконечников к пипеточным дозаторам, проби­рок типа Эппендорф (при аликвотировании образцов) и иммунологических планшетов, применяемых для приготовления промежуточных разведений. В качестве оправдания обычно ссылаются на отсутствие достаточных финансо­вых средств на приобретение, однако это нельзя считать веским аргументом, т. к. пластик относится к расходным материалам однократного применения, и его повторное использование должно быть прекращено.

Особо следует выделить причины ложноположительных результатов, не за­висящие от сотрудников лаборатории. Наиболее часто неправильный результат встречается при определении специфических антител класса и может быть обусловлен наличием ревматоидного фактора, гиперпродукцией IgM при бере­менности, перекрестной реакцией с антигенами других возбудителей, аутоим­мунным процессом, нарушением обмена веществ, гиперлипидемией и др. В данном случае получить достоверный результат анализа позволяет использо­вание ряда лабораторных приемов, а именно:

  • удаление ревматоидного фактора из сыворотки с использованием сор­бента;
  • использование на первом этапе постановки либо в качестве уточняющих тестов высокоспецифичных тест-систем зарубежного или отечественного производства;
  • повторное исследование сыворотки;
  • применение в качестве подтверждающего теста иммуноблота (western blot-IgM), предназначенного для выявления антител именно класса IgM к от­дельным антигенам возбудителя.

Наряду с этим следует помнить, что антитела класса IgM являются показа­телем острого и активного инфекционного процесса. Обнаружение ДНК возбу­дителя (методом полимеразной цепной реакции) либо его антигенов прямыми методами или появление в динамике антител других классов в результате пере­ключения синтеза антител позволяют верифицировать диагноз. При детекции антител класса IgG также может быть получен ложноположительный результат, связанный прежде всего с перекрестным реагированием антигенов и напрямую зависящий от специфичности тест-систем. Для уточнения лабораторного диа­гноза и исключения ложноположительного результата следует применять иммуноблот (western blot-IgG), предназначенный для обнаружения антител класса IgG к отдельным высокоспецифичным белкам патогена.

С целью уточнения лабораторного диагноза и установления частоты лож-ноположительных результатов нами были подвергнуты анализу 295 образцов крови от пациентов, у которых при тестировании крови методом ИФА в раз­личных лабораториях выявлены антитела к Tr. pallidum. Материалом для иссле­дования служила сыворотка крови, взятая с применением закрытых систем в вакуумные пробирки.

Для подтверждения лабораторного диагноза были использованы наборы реагентов для определения антител классов и IgG, содержащие электрофо-ретически разделенные антигены Tr. pallidum: p15, p17, p22, p45 и p47. Из них специфичными являются 4 белка: мембранный белок Tp47, TmpA (полоса на стрипе 45 кДа), мембранный белок Tp17, мембранный белок Tp15. Наличие не­специфической полосы 22 кДа с антигеном Р22 имело принципиальное значе­ние и в ряде случаев объясняло наличие ложноположительного результата, по­лученного при проведении ИФА.

Постановка реакции проводилась в строгом соответствии с инструкцией. Интерпретация результатов выполнялась согласно рекомендациям производи­теля тест-системы с учетом положения полос и их интенсивности.

Все 295 образцов сыворотки крови были подвергнуты исследованию на присутствие антител класса IgG и 290 образцов - на присутствие антител клас­са к специфическим антигенам. Результаты исследования показали, что по результатам подтверждающего теста (блота) 36,2% образцов были позитивны по и 75,6% образцов - по IgG. Три образца имели неспецифическую полосу с антигеном Р22, что позволило сделать заключение об отсутствии лаборатор­ных признаков сифилиса.

При детекции наличие одной четкой полосы, указывающей на присут­ствие специфического антигена, расценивали как положительный результат, который был отмечен в 37 пробах (35,2% от числа позитивных проб). Полоса соответствовала: у 20 чел. - мембранному белку Tp47, 9 чел. - Tp17, 5 чел. -TmpA, 3 чел. - Tp15. У 41 пациента присутствовали 2 специфических белка в различных комбинациях, в остальных случаях - 3 и 4 специфических белка. У 68 пациентов с одной либо двумя положительными полосами, указывающими на присутствие антител класса М, обследованных в динамике, появились спе­цифические антитела класса IgG, что свидетельствовало о переключении синте­за антител и подтверждало развитие инфекционного процесса.

При оценке данных по IgG наличие одной полосы, которое имело место у 27 пациентов (в 12,0% случаев от серопозитивных в блоте), расценивалось как неопределенный (сомнительный) результат. В таких случаях проводили парал­лельную оценку результатов тестирования на присутствие антител класса к специфическим белкам либо рекомендовали обследование в динамике. Нали­чие двух и более полос, указывающих на присутствие антител класса к спе­цифическим белкам, расценивали как положительный результат: у 44 чел. выяв­лены антитела к 2 белкам, у 42 чел. - 3 белкам и у 110 чел. - 4 белкам (р15, р17, р45, р47).

Таким образом, применение иммуноблота показало, что в 25% случаев ре­зультат исследования методом ИФА является ложноположительным, что обос­новывает необходимость применения подтверждающего теста и целесообраз­ность включения иммуноблота в медицинские стандарты.

Т.И. Долгих,руководитель центра, заведующая Центральной научно-исследовательской лабораторией,
Центральная научно-исследовательская лаборатория и Академический центр лабораторной диагностики
ГОУ ВПО "Омская государственная медицинская академия"

Рекомендации по теме

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Мы в соцсетях
А еще:
Сайт предназначен для медицинских работников!


Материалы для zdrav.ru готовят лучшие эксперты в сфере здравоохранения. Чтобы защитить их авторские права, многие статьи на нашем сайте закрыты

Подтвердите ваш статус медработника - регистрация займет одну минуту.

Пакет готовых инструкций, чтобы пройти проверку Росздравнадзора в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Сайт предназначен для медицинских работников!


Материалы для zdrav.ru готовят лучшие эксперты в сфере здравоохранения. Чтобы защитить их авторские права, многие статьи на нашем сайте закрыты

Подтвердите ваш статус медработника - регистрация займет одну минуту.

Пакет готовых инструкций, чтобы пройти проверку Росздравнадзора в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
×

Гость, вам предоставлен VIP-доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ»:
возможность скачивать шаблоны • доступ к видеотренингам • книги для КДЛ
Активировать доступ  
Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.