Протеомика в ревматологии

2408
Протеомика в ревматологии

В ходе развития молекулярной биологии стало очевидным, что процессы, протекающие в организме на генетическом, клеточном и онтогенетическом уровне, не могут быть полностью описаны на основе только геномных исследований. Не менее важной является информация о свойствах белков и их роли в живых системах. Появление высокотехнологичных методов, позволяющих идентифицировать первичную структуру и посттрансляционные модификации белка, определить белковый состав биологических объектов, обусловило быстрое развитие протеомики [2]. Протеомные исследования в ревматологии могут преследовать следующие цели: поиск диагностических биомаркеров, идентификация терапевтических мишеней и разработка методов оценки эффективности терапии [10].

Протеомные методы

Двумерный (2D) электрофорез в геле (гель-электрофорез) и массспектрометрический анализ (MS) являются основными методами изучения посттрансляционных модификаций белков и поиска биомаркеров [1].

Двумерный гель-электрофорез – метод разделения смеси белков, основанный на использовании их электрических зарядов и молекулярных масс. Хорошо зарекомендовав себя при скрининговых исследованиях и работе с эукариотами, обладающими небольшим количеством закодированных в геноме белков, в области изучения протеома человека данный метод оказался менее эффективным. Анализ многокомпонентных белково-пептидных смесей, обладающих различными физико-химическими свойствами, с помощью 2D гель-электрофореза часто не приводит к желаемым результатам.

Считается, что для разделения белков более целесообразно использовать многостадийные технологии с преимущественным использованием 2D хроматографии, специализированных хроматографических чипов и их комбинаций с такими технологическими приемами, как твердофазная экстракция, осаждение, истощение и т. д. [11].

Поиск и валидация биомаркеров заболеваний невозможны без количественного профилирования биологических образцов. MS – физико-химический вид анализа, заключающийся в ионизации молекул исследуемого образца с последующим разделением и регистрацией образующихся ионов. Наиболее часто используются время-пролетный (time of fl ight, TOF) MS, матрица-ассоциированная лазерная десорбция-ионизация (matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI) и усиленная поверхностью лазерная десорбция-ионизация (surface-enhanced laser desorption/ ionization, SELDI) [4].

Однако эти методы имеют ряд ограничений, основным из которых является низкий динамический диапазон измерений молекулярных масс (103–104). В связи с этим стали развиваться технологии количественной оценки пептидов/белков, использующие изотопные метки, а также методы, стандартизующие хроматографическое разделение или использующие внутренние пептидные стандарты для калибровки. Одновременно совершенствуются гибридные технологии, в которых хроматографическое разделение пептидов/белков сочетается с MALDI-TOF MS [1].

Белковые микрочипы (биочипы)

Биочипы, способные проводить быстрое сверхчувствительное определение множества аналитов в одном образце, широко применяются в протеомных исследованиях, демонстрируя огромный потенциал в идентификации и изучении функций белков с точки зрения протеома в целом (табл. 1) [15]. Их функционирование основано на способности биологических макромолекул к высокоспецифичному связыванию с другими молекулами.

В зависимости от цели использования биочипы можно разделить на аналитические и функциональные. Аналитические биочипы используются для выявления белковых профилей в биологических жидкостях и тканях, функциональные – для изучения биохимических особенностей протеома. Аналитическая чувствительность биочипов примерно в два раза выше, чем при иммунофлуоресцентном и иммуноферментном анализе. Однако их специфичность и аффинность сильно зависят от природы белка: структуры, размера, наличия гидрофобных или гетерофильных боковых цепей, посттрансляционных модификаций.

Главным элементом биочипов является совокупность микроячеек (планарные микрочипы) или суспензия кодируемых микроносителей, содержащих молекулярные зонды (суспензионные микрочипы), специфичные к одной из множества биологических молекул или их фрагментов (последовательностям ДНК, РНК, белкам) [3].

В планарных биочипах процесс идентификации исследуемых объектов основан на определенном пространственном расположении зондов или использовании индивидуальных меток. Биочипы при размере менее 1 см2 могут содержать до 10 тыс. белковых зондов, количество которых возможно увеличивать, используя нанопроточные устройства, нанолитографию и микроконтактную печать. Планарные биочипы подходят для параллельного выполнения множества индивидуальных тестов. Однако при их использовании скорость получения и качество результатов ограничены свойствами плоской подложки. Суспензионные биочипы обладают целым рядом преимуществ перед планарными, они лишены диффузных ограничений, обладают лучшими кинетическими и сепарационными свойствами.

Кроме этого, возможность создавать суспензии из микроносителей с различной кодировкой позволяет гибко адаптировать суспензионные биочипы под условия конкретного эксперимента. Для кодировки микросфер используют спектрометрический, графический, электронный и физические методы.

Поиск биомаркеров ревматических заболеваний

Биомаркером принято считать показатель, который можно объективно измерить, оценить и использовать в качестве индикатора нормального или патологического процесса в организме или ответа на проводимую терапию. Теоретически каждое заболевание должно обладать своим уникальным биомаркером. “Идеальный” биомаркер должен иметь высокую диагностическую чувствительность, специфичность и позволять поставить верный диагноз даже в отсутствие клинических признаков заболевания. Простота использования, стандартизация, возможность четкой интерпретации являются основными условиями успешного внедрения биомаркера в клиническую практику [13].

В основе стратегии поиска биомаркеров лежит выявление из общего количества исследуемых показателей т. н. “кандидатных”, обладающих наилучшей диагностической чувствительностью и специфичностью. В процессе исследования пропорционально снижению числа “кандидатных” биомаркеров должно возрастать количество анализируемых образцов, что создает определенные проблемы в связи с отсутствием соответствующего высокопроизводительного оборудования. Так, при выявлении профиля из 1000 белков методом жидкостной хроматографии/ масс-спектрометрии (LS/MS) один образец можно обработать лишь за сутки.

В результате в исследование редко включают более 10 образцов биоматериала, что не позволяет провести полноценный статистический анализ, однако в большинстве случаев этот факт исследователями игнорируется. Несмотря на большое количество выявленных “кандидатных” биомаркеров различных заболеваний, основное их количество обладает небольшим клиническим значением. Следующим шагом является валидация “кандидатных” биомаркеров, при которой уже используются сотни образцов биоматериала и в каждом определяется порядка 10 аналитов. На данном этапе применяются иммунологические методы исследований, ограничением которых является отсутствие качественных антител.

Альтернативным методом может служить MS, недостатком его является существенная длительность исследования: на анализ 1 образца требуется около 1 ч, и в среднем 40 дней – на все исследование. Большинство выявляемых маркеров относятся к белкам острой фазы воспаления или синтезируются в ответ на внешние стрессовые факторы (например медикаментозную терапию). Эти белки, составляя основную массу в сыворотке/плазме крови, мешают выделению истинных болезнь-специфичных показателей.

В фазе клинической апробации, когда необходимо исследовать тысячи образцов, а MS уже неэффективен в связи с плохим сочетанием производительности и точности, используются методы, обладающие большой пропускной способностью, позволяющие тестировать максимально возможное количество аналитов в одном образце [14].

К настоящему времени не удалось обнаружить лабораторный маркер, который выявлялся бы только при одном конкретном ревматическом заболевании, поэтому, с целью повышения диагностической точности, в лабораторной практике начинают применяться диагностические индексы, полученные путем многопараметрического анализа in vitrо (In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assay, IVDMIA). При их разработке следует учитывать ряд рекомендаций, выполнение которых приводит к повышению аналитической и клинической точности результатов. Необходимо строгое соблюдение правил преаналитического этапа для всех биологических образцов, включенных в исследование.

Для получения достоверных результатов отношение числа образцов биоматериала к количеству исследуемых биомаркеров должно быть не менее 10:1. Кроме этого, важно оценить аналитическую и диагностическую точность каждого биомаркера в отдельности[9]. Критерии качества IVDMIA:

~ оценка аналитических характеристик (точность, чувствительность, линейность, воспроизводимость и др.) каждого биомаркера;

~ соответствие диагностической чувствительности и специфичности каждого аналита таковой при его индивидуальном определении;

~ меньшая длительность исследования, чем суммарно затраченное время на определение всех аналитов по-отдельности;

~ клиническая информативность комбинации определяемых аналитов. Критерии достоверности IVDMIA:

~ демографическая и клиническая сопоставимость всех групп лиц, включенных в исследование;

~ стандартизация преаналитического этапа;

~ достаточное для корректной статистической обработки (создания индекса) количество биологических образцов;

~ подтверждение диагностической чувствительности и специфичности теста (помимо групп больных, входящих в эксперимент) в общей популяции;

~ сопоставимость диагностической точности индекса с таковой всех входящих в него компонентов;

~ диагностическая эффективность теста должна быть выше, чем у рутинно применяющегося однопараметрического теста.

Поиск новых биомаркеров ревматических заболеваний, обладающих высокой диагностической точностью, является важной задачей современной ревматологии. При исследовании мочи пациентов с системной красной волчанкой, у лиц с люпус-нефритом было выявлено повышение гипсидина, сывороточного амилоида P (САР), простагландина D2 (ПГ D2), супероксиддисмутазы, ренина и протеазы. Протеомный состав слюнных желез больных синдромом Шегрена характеризовался гиперэкспрессией таких белков, как β-актин, α-дефенсин, кальмодулин, кальгранулин и кератин. Повышенный уровень последнего ассоциировался с поражением ацинозных клеток, а содержание кальмодулина и кальгранулина отражало активность воспалительного процесса.

У пациентов с остеоартрозом в хондроцитах хряща при помощи 2D гель-электрофореза и MS было идентифицировано 20 белковых “кандидатных” маркеров заболевания. Однако при дальнейших исследованиях наличие диагностического значения подтвердилось только для сериновой протеазы (HtrA1), коллагена и виментина. А. Claudon и соавт. с помощью планарных микрочипов выявили снижение таких маркеров костного метаболизма, как CTX-1, PINP и остеокальцин, у 56 женщин в постменопаузе с остеопорозом на фоне терапии ибандронатом, после 6 месяцев применения препарата [6].

В результате протеомных исследований синовиальной ткани, а также сыворотки и плазмы крови при ревматоидном артрите с использованием MS было выявлено около трех десятков белков, ассоциирующихся с заболеванием.

Особый интерес вызвали сывороточный амилоидный белок А (САА), супероксиддисмутаза, триоз-фосфат изомераза, т. к. их повышение было выявлено независимыми исследователями. Было установлено, что, в отличие от других ревматических заболеваний, при ревматоидном артрите чаще обнаруживается белковый гетерокомплекс S100A8/S100A9. K. Raza и соавт., используя суспензионные биочипы, провели исследование цитокинового профиля синовиальной жидкости у больных ревматоидным артритом и пациентов с другими вариантами неревматоидного персистирующего артрита на ранней стадии заболевания. Авторами показано транзиторное увеличение концентрации интерлейкина ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ13, ИЛ-17, ИЛ-15, фактора роста фибробластов (ФРФ)-β и эпидермального фактора роста у больных с ранним ревматоидным артритом и повышение уровня интерферона (ИФН)-γ при недифференцированном и псориатическом артрите. W. Hueber и совт. выявили при раннем ревматоидном артрите достоверное увеличение концентрации провоспалительных цитокинов: ИЛ-1α, фактора некроза опухоли (ФНО)-α, ИЛ-12р40, ИЛ-13 и хемокинов – ИФН-γ-индуцибельного белка (ИБ-10), моноцитарного хемоаттрактного белка (МХБ)-1, эотаксина, а при псориатическом артрите и спондилоартрите – ИЛ-8. S.

Syversen и соавт. сделали вывод об ассоциации содержания эотаксина в сыворотке крови с рентгенологической прогрессией суставной деструкции. W. Jager и соавт. выявили повышение уровня ФНО-α, фактора, ингибирующего миграцию макрофагов, МХБ-1, макрофагального воспалительного белка (МВБ)-1α, эотаксина-1, макрофаг-производного хемокина и CXCL9 в плазме крови больных ювенильным идиопатическим артритом. При этом в синовиальной жидкости увеличение концентрации ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-15, МХБ-1, (МВБ)-1α и ИФН-γиндуцибельного белка (ИБ-10) было более выраженным, чем в плазме [7].

К настоящему времени накопленная информация об особенностях белкового профиля при ревматоидном артрите позволила создать IVDMIA для определения индекса активности болезни, основанный на измерении концентрации 12 ключевых белков (молекулы адгезии сосудистого эндотелия первого типа, эпидермального фактора роста, васкулоэндотелиального фактора роста, ИЛ-6, ФНОP1, ММП-1, -3, хрящевого гликопротеина-39, лептина, резистина, САА и С-реактивного белка, ассоциирующихся с определенными компонентами DAS28) [5].

Таким образом, использование современных протеомных технологий, позволяющих модифицировать имеющиеся и создавать новые концепции поиска и валидации биомаркеров, открывает широкие перспективы развития лабораторной диагностики ревматических заболеваний.

Список использованной литературы

1. Говорун В.М., Иванов В.Т. Протеомика и пептидомика в фундаментальных и прикладных медицинских исследованиях // Биоорганическая химия. 2011. № 2. С. 199–215.

2. Олейников А.В. Полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы (квантовые точки) в белковых биочипах // Биоорганическая химия. 2011. № 2. С. 171–189.

3. Чечеткин Д.В., Прокопенко Д.В., Макаров А.А. и др. Биочипы для медицинской диагностики // Российские нанотехнологии. 2006. № 1, 2. С. 13–27.

4. Anderson N.L, Anderson N.G. Th e human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects // Mol. Cell. Proteomics. 2002. Vol. 1. P. 845–867.

5. Cavet G., Centola M., Shen Y. et al. Development of a Multi-Biomarker Test for Rheumatoid Arthritis (RA) Disease Activity // Ann. Rheum. Dis. 2010. Vol. 69. P. 148.

6. Claudon A., Vergnaud P., Valverde C. et al. New automated multiplex assay assay for bone turnover markers in osteoporosis // Clin. Chem. 2008. Vol. 54. P. 1554–1563.

7. Davis J., Matteson E. Cytokine biomarkers and the promise of personalized therapy in rheumatoid arthritis // Reumatol. Clin. 2009. Vol. 5. P. 143–146.

8. Gibson D.S., Rooney M.E., Finnegan S. et al. Biomarkers in rheumatology, now and in the future // Rheumatology (Oxford). 2012. Vol. 51. P. 423–433.

9. Katz M.H. Multivariable analysis: a primer for readers of medical research // Ann. Intern. Med. 2003. Vol. 138. P. 644–650.

10. Lambrecht S., Tilleman K., Elewaut D. et al. Proteomics in rheumatology: The beginning of a fairy tale? // Proteomics Clin. Appl. 2008. Vol. 2(3). P. 411–419.

11. Matt P., Fu Z., Fu Q. et al. Biomarker discovery: proteome fractionation and separation in biological samples // Physiol. Genomics. 2008. Vol. 33. P. 12–17.

12. Nolan J.P, Sklar L.A. Suspension array technology: evolution of the latarray paradigm // Trends Biotechnol. 2002. Vol. 20. P. 9–12.

13. Rifai N., Gillette M.A., Carr S.A. Protein biomarker discovery and validation: the long and uncertain path to clinical utility // Nat. Biotechnol. 2006. Vol. 24. P. 971–983.

14. Tambor V., Fučíková A., Lenčo J. et al. Application of Proteomics in Biomarker Discovery: a Primer for the Clinician // Physiol. Res. 2010. Vol. 59. P. 471–497.

15. Zhu H., Bilgin M., Bangham R. et al. Global analysis of protein activities using proteome chips // Science. 2001. Vol. 293. P. 2101–2105. 

*Статья приведена с сокращениями

Перейти к другим публикациям

Узнать о подписке на журнал

Читайте в ближайших номерах журнала «Справочник заведующего КДЛ»
    Читать >>


    Ваша персональная подборка

      Подписка на статьи

      Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

      Рекомендации по теме

      Мероприятия

      Мероприятия

      Повышаем квалификацию

      Посмотреть

      Самое выгодное предложение

      Самое выгодное предложение

      Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

      Живое общение с редакцией

      А еще...








      Наши продукты






















      © МЦФЭР, 2006 – 2017. Все права защищены.

      Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

      Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
      Свидетельство о регистрации средства массовой информации ПИ № ФС77-64203 от 31.12.2015.

      Политика обработки персональных данных

      
      • Мы в соцсетях
      Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×