text

🎁 УЛЁТНЫЕ СКИДКИ 30%! Поймать »

Здравоохранение

Оценка возможности применения автоматического выделения ДНК для HLA -типирования молекулярно-биологическими методами

  • 16 октября 2013
  • 2238
Оценка возможности применения автоматического выделения ДНК для HLA -типирования молекулярно-биологическими методами

...Целью нашего исследования было изучение возможности применения автоматического выделения ДНК с помощью процессора магнитных частиц Thermo Scientifi c KingFisher 96 и набора реактивов AGATA (Protrans, Германия) для HLA- типирования методами ПЦР-SSP и секвенирования. Объектами исследования служили 310 образцов крови доноров гемокомпонентов, 95 образцов замороженной крови больных с патологиями сердечно-сосудистой и эндокринной систем, 10 образцов крови больных с онкогематологическими заболеваниями, 253 образца замороженной пуповинной крови, 19 образцов замороженной крови рожениц и новорожденных. Выделение ДНК осуществляется из крови, взятой в стерильную пробирку с ЭДТА. Минимальный объем образца составлял 2,0 мл. Образцы крови хранились в холодильнике при температуре 4 °С или в морозильной камере при температуре -40 °С.

ДНК выделяли по методике, предложенной производителем набора реагентов. Для чего перед началом работы добавляли:

Внимание! Для скачивания доступна новая книга:  «Молекулярно-биологические исследования» ,

~ 1,5 мл бидистиллированной воды к протеиназе K. Раствор перемешивали и хранили при температуре -20 °С. Повторное размораживание снижает активность протеиназы, поэтому перед замораживанием ее аликвотировали в пробирки по 100,0 мкл для удобства дальнейшего использования;

~ 90,0 мл 96,0–99,8% этанола в промывочный раствор A;

~ 720,0 мл 96,0–99,8% этанола в промывочный раствор B.

Приготовленные растворы перемешивали и хранили при комнатной температуре.

Затем следовала двухэтапная процедура выделения ДНК из 200,0 мкл крови. На первом этапе осуществлялись лизис эритроцитов и отмывание лейкоцитов, на втором с помощью взвеси магнитных частиц по стандартной программе получали планшет, содержащий в лунках элюат ДНК, защищенный от деградации. Если в элюате ДНК содержались магнитные частицы, планшет центрифугировали 3 мин при 12 000 об/мин и переносили супернатант в новый 96-луночный планшет или пробирки типа Eppendorf.

Для ручного процесса выделения ДНК использовали колоночный метод с наборами реагентов DNA Box500 (Protrans, Германия). Этот метод применялся для 170 образцов крови больных различными онкогематологическими заболеваниями и 137 образцов крови потенциальных доноров гемопоэтических стволовых клеток и 48 образцов пуповинной крови.

Измерение концентрации ДНК проводили по стандартной методике, в 1,5 мкл полученного элюата, на спектрофотометре для молекулярно-биологических исследований Th ermo Scientifi c NanoDrop 1000.

Полученные образцы ДНК использовали для HLA-типирования методами ПЦР-SSP и SBT в нативном виде в течение 2 недель (температура хранения 4 °С) или же замораживали для более длительного хранения при -20 °С.

Анализ полученных данных показал, что большинство образцов ДНК (67,0%) находится в диапазоне концентраций 10,0–50,0 нг/мкл. При этом в группе доноров гемокомпонентов и гематологических больных этот процент максимальный (91,0 и 90,0%). Группа гематологических больных была малочисленной (n = 10), т. к. большее количество образцов крови таких пациентов для автоматического выделения ДНК получить одновременно не представлялось возможным. Это связано с тем, что 96-луночный формат планшета для выделения ДНК подразумевает накопление материала, а поступающие в лабораторию образцы нуждаются, как правило, в срочном исследовании, поэтому ДНК из них выделяли ручным колоночным методом. В группе больных сердечно-сосудистыми заболеваниями, рожениц и новорожденных также максимальное количество образцов пришлось на данный диапазон концентраций ДНК – 75,0 и 58,0% соответственно. Для пуповинной крови это количество составило только 35,0%, а большинство образцов (51,0%) при автоматическом выделении ДНК находилось в диапазоне концентраций 1,0–10,0 нг/мкл. Такая низкая концентрация ДНК в образцах пуповинной крови была неожиданна, но, по-видимому, это связано с тем, что автоматическому выделению ДНК мы подвергали только образцы, прошедшие процедуру

обязательных исследований, а следовательно, неоднократно дефростированные и вновь замороженные.

Большинство производителей наборов реагентов для HLA-типирования методом ПЦР-SSP рекомендуют для достижения наилучших результатов применять диапазон концентраций ДНК от 50,0 до 100,0 нг/мкл, а также использовать высокоочищенную ДНК – соотношение концентраций, измеряемых при длинах волн 260/280 нм, должно находиться в пределах 1,6–1,9. Исследуемые образцы ДНК в основном удовлетворяли последнему требованию. Что же касается концентраций, то в зависимости от образцов крови для выделения ДНК их значения в конечном продукте при автоматическом выделении ДНК варьировали от 0,5 до 126,0 нг/мкл. Как оказалось, в указанном производителями реагентов диапазоне концентраций 50,0–100,0 нг/мкл находилось 14,0% образцов ДНК больных сердечно-сосудистыми заболеваниями, 13,0% образцов ДНК пуповинной крови, 5,0% образцов ДНК крови рожениц и новорожденных и лишь 8,0% образцов ДНК крови доноров гемокомпонентов. Оценивая уровни концентраций ДНК, полученных при ручном методе выделения, мы обнаружили, что только 20,0% образцов ДНК потенциальных доноров гемопоэтических стволовых клеток, 48,0% образцов ДНК пуповинной крови и 24,0% образцов ДНК гематологических больных отвечали этим требованиям.

По опыту работы методом ПЦР-SSP с образцами крови гематологических больных, нам было известно, что метод хорошо работает и при низких концентрациях ДНК, демонстрируя подчас значительно более четкие результаты при детекции методом электрофореза в агарозном геле. Поэтому нами были подвергнуты первоочередному анализу 12 образцов с низкой (1,0–10,0 нг/мкл) и 3 образца с очень низкой (менее 1,0 нг/мкл) концентрацией ДНК, полученные при автоматическом выделении. Все образцы с низкой концентрацией ДНК позволили получить удовлетворительные результаты HLA-типирования методом ПЦР-SSP. К сожалению, образцы с очень низкой концентрацией ДНК (менее 1,0 нг/мкл) четких результатов типирования не дали, поэтому для них экстракцию ДНК пришлось выполнять повторно ручным методом. Всего же HLA-типирование методом ПЦР-SSP успешно проведено для 98 образцов ДНК, выделенных с помощью автоматического метода. Кроме того, 4 образца дополнительно были исследованы методом секвенирования. По нашим наблюдениям, оптимальным диапазоном концентраций для осуществления HLA-типирования методом ПЦР-SSP является 10,0–50,0 нг/мкл.

Таким образом, данные нашего исследования позволяют рекомендовать при HLA-типировании молекулярно-биологическими методами для большого количества образцов крови, как свежезаготовленной, так и замороженной, использовать автоматическое выделение ДНК. Обязательным при этом должно быть измерение концентрации экстрагированной ДНК. Образцы с высокой концентрацией ДНК (более 50,0 нг/мкл) можно для проведения исследований разводить деионизированной водой до концентрации 10,0–50,0 нг/мкл. Образцы с низкой концентрацией ДНК (1,0–10,0 нг/мкл) использовать для HLA-типирования методом ПЦР-SSP возможно. При очень низких концентрациях ДНК (менее 1,0 нг/мкл) требуется повторение экстрагирования для получения более адекватных методу типирования образцов ДНК.

*Статья опубликована с сокращениями, полностью публикацию читайте в бумажной версии  

Перейти к другим публикациям

Узнать о подписке на журнал

Рекомендации по теме

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Мы в соцсетях
А еще:
Сайт предназначен для медицинских работников!


Материалы для zdrav.ru готовят лучшие эксперты в сфере здравоохранения. Чтобы защитить их авторские права, многие статьи на нашем сайте закрыты

Подтвердите ваш статус медработника - регистрация займет одну минуту.

Пакет готовых инструкций, чтобы пройти проверку Росздравнадзора в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Зарегистрироваться
Сайт предназначен для медицинских работников!


Материалы для zdrav.ru готовят лучшие эксперты в сфере здравоохранения. Чтобы защитить их авторские права, многие статьи на нашем сайте закрыты

Подтвердите ваш статус медработника - регистрация займет одну минуту.

Пакет готовых инструкций, чтобы пройти проверку Росздравнадзора в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Зарегистрироваться
×
Журнал
Гость, Ваш бесплатный доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ» сгорает через

Гость, вам предоставлен VIP-доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ»:
возможность скачивать шаблоны • доступ к видеотренингам • книги для КДЛ
Активировать доступ  
Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.