text
Портал для медицинских работников

Оценка возможности применения автоматического выделения ДНК для HLA -типирования молекулярно-биологическими методами

  • 16 октября 2013
  • 2238
Оценка возможности применения автоматического выделения ДНК для HLA -типирования молекулярно-биологическими методами

...Целью нашего исследования было изучение возможности применения автоматического выделения ДНК с помощью процессора магнитных частиц Thermo Scientifi c KingFisher 96 и набора реактивов AGATA (Protrans, Германия) для HLA- типирования методами ПЦР-SSP и секвенирования. Объектами исследования служили 310 образцов крови доноров гемокомпонентов, 95 образцов замороженной крови больных с патологиями сердечно-сосудистой и эндокринной систем, 10 образцов крови больных с онкогематологическими заболеваниями, 253 образца замороженной пуповинной крови, 19 образцов замороженной крови рожениц и новорожденных. Выделение ДНК осуществляется из крови, взятой в стерильную пробирку с ЭДТА. Минимальный объем образца составлял 2,0 мл. Образцы крови хранились в холодильнике при температуре 4 °С или в морозильной камере при температуре -40 °С.

ДНК выделяли по методике, предложенной производителем набора реагентов. Для чего перед началом работы добавляли:

Внимание! Для скачивания доступна новая книга:  «Молекулярно-биологические исследования» ,

~ 1,5 мл бидистиллированной воды к протеиназе K. Раствор перемешивали и хранили при температуре -20 °С. Повторное размораживание снижает активность протеиназы, поэтому перед замораживанием ее аликвотировали в пробирки по 100,0 мкл для удобства дальнейшего использования;

~ 90,0 мл 96,0–99,8% этанола в промывочный раствор A;

~ 720,0 мл 96,0–99,8% этанола в промывочный раствор B.

Приготовленные растворы перемешивали и хранили при комнатной температуре.

Затем следовала двухэтапная процедура выделения ДНК из 200,0 мкл крови. На первом этапе осуществлялись лизис эритроцитов и отмывание лейкоцитов, на втором с помощью взвеси магнитных частиц по стандартной программе получали планшет, содержащий в лунках элюат ДНК, защищенный от деградации. Если в элюате ДНК содержались магнитные частицы, планшет центрифугировали 3 мин при 12 000 об/мин и переносили супернатант в новый 96-луночный планшет или пробирки типа Eppendorf.

Для ручного процесса выделения ДНК использовали колоночный метод с наборами реагентов DNA Box500 (Protrans, Германия). Этот метод применялся для 170 образцов крови больных различными онкогематологическими заболеваниями и 137 образцов крови потенциальных доноров гемопоэтических стволовых клеток и 48 образцов пуповинной крови.

Измерение концентрации ДНК проводили по стандартной методике, в 1,5 мкл полученного элюата, на спектрофотометре для молекулярно-биологических исследований Th ermo Scientifi c NanoDrop 1000.

Полученные образцы ДНК использовали для HLA-типирования методами ПЦР-SSP и SBT в нативном виде в течение 2 недель (температура хранения 4 °С) или же замораживали для более длительного хранения при -20 °С.

Анализ полученных данных показал, что большинство образцов ДНК (67,0%) находится в диапазоне концентраций 10,0–50,0 нг/мкл. При этом в группе доноров гемокомпонентов и гематологических больных этот процент максимальный (91,0 и 90,0%). Группа гематологических больных была малочисленной (n = 10), т. к. большее количество образцов крови таких пациентов для автоматического выделения ДНК получить одновременно не представлялось возможным. Это связано с тем, что 96-луночный формат планшета для выделения ДНК подразумевает накопление материала, а поступающие в лабораторию образцы нуждаются, как правило, в срочном исследовании, поэтому ДНК из них выделяли ручным колоночным методом. В группе больных сердечно-сосудистыми заболеваниями, рожениц и новорожденных также максимальное количество образцов пришлось на данный диапазон концентраций ДНК – 75,0 и 58,0% соответственно. Для пуповинной крови это количество составило только 35,0%, а большинство образцов (51,0%) при автоматическом выделении ДНК находилось в диапазоне концентраций 1,0–10,0 нг/мкл. Такая низкая концентрация ДНК в образцах пуповинной крови была неожиданна, но, по-видимому, это связано с тем, что автоматическому выделению ДНК мы подвергали только образцы, прошедшие процедуру

обязательных исследований, а следовательно, неоднократно дефростированные и вновь замороженные.

Большинство производителей наборов реагентов для HLA-типирования методом ПЦР-SSP рекомендуют для достижения наилучших результатов применять диапазон концентраций ДНК от 50,0 до 100,0 нг/мкл, а также использовать высокоочищенную ДНК – соотношение концентраций, измеряемых при длинах волн 260/280 нм, должно находиться в пределах 1,6–1,9. Исследуемые образцы ДНК в основном удовлетворяли последнему требованию. Что же касается концентраций, то в зависимости от образцов крови для выделения ДНК их значения в конечном продукте при автоматическом выделении ДНК варьировали от 0,5 до 126,0 нг/мкл. Как оказалось, в указанном производителями реагентов диапазоне концентраций 50,0–100,0 нг/мкл находилось 14,0% образцов ДНК больных сердечно-сосудистыми заболеваниями, 13,0% образцов ДНК пуповинной крови, 5,0% образцов ДНК крови рожениц и новорожденных и лишь 8,0% образцов ДНК крови доноров гемокомпонентов. Оценивая уровни концентраций ДНК, полученных при ручном методе выделения, мы обнаружили, что только 20,0% образцов ДНК потенциальных доноров гемопоэтических стволовых клеток, 48,0% образцов ДНК пуповинной крови и 24,0% образцов ДНК гематологических больных отвечали этим требованиям.

По опыту работы методом ПЦР-SSP с образцами крови гематологических больных, нам было известно, что метод хорошо работает и при низких концентрациях ДНК, демонстрируя подчас значительно более четкие результаты при детекции методом электрофореза в агарозном геле. Поэтому нами были подвергнуты первоочередному анализу 12 образцов с низкой (1,0–10,0 нг/мкл) и 3 образца с очень низкой (менее 1,0 нг/мкл) концентрацией ДНК, полученные при автоматическом выделении. Все образцы с низкой концентрацией ДНК позволили получить удовлетворительные результаты HLA-типирования методом ПЦР-SSP. К сожалению, образцы с очень низкой концентрацией ДНК (менее 1,0 нг/мкл) четких результатов типирования не дали, поэтому для них экстракцию ДНК пришлось выполнять повторно ручным методом. Всего же HLA-типирование методом ПЦР-SSP успешно проведено для 98 образцов ДНК, выделенных с помощью автоматического метода. Кроме того, 4 образца дополнительно были исследованы методом секвенирования. По нашим наблюдениям, оптимальным диапазоном концентраций для осуществления HLA-типирования методом ПЦР-SSP является 10,0–50,0 нг/мкл.

Таким образом, данные нашего исследования позволяют рекомендовать при HLA-типировании молекулярно-биологическими методами для большого количества образцов крови, как свежезаготовленной, так и замороженной, использовать автоматическое выделение ДНК. Обязательным при этом должно быть измерение концентрации экстрагированной ДНК. Образцы с высокой концентрацией ДНК (более 50,0 нг/мкл) можно для проведения исследований разводить деионизированной водой до концентрации 10,0–50,0 нг/мкл. Образцы с низкой концентрацией ДНК (1,0–10,0 нг/мкл) использовать для HLA-типирования методом ПЦР-SSP возможно. При очень низких концентрациях ДНК (менее 1,0 нг/мкл) требуется повторение экстрагирования для получения более адекватных методу типирования образцов ДНК.

*Статья опубликована с сокращениями, полностью публикацию читайте в бумажной версии  

Перейти к другим публикациям

Узнать о подписке на журнал

Рекомендации по теме

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Мы в соцсетях
А еще:
Сайт предназначен для медицинских работников!


Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

Читайте экспертные
материалы

Скачивайте готовые
формы и СОПы

Смотрите
бесплатные вебинары

13 000 статей

1 500 инструкций

200 записей

Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!


Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, зарегистрируйтесь, и:

Читайте экспертные
материалы

Скачивайте готовые
формы и СОПы

Смотрите
бесплатные вебинары

13 000 статей

1 500 инструкций

200 записей

Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×

×

Гость, вам предоставлен VIP-доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ»:
возможность скачивать шаблоны • доступ к видеотренингам • книги для КДЛ
Активировать доступ  
Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.