Новые подходы к определению антинуклеарных антител при системных аутоиммунных ревматических заболеваниях

5794
Новые подходы к определению антинуклеарных антител при системных аутоиммунных ревматических заболеваниях

Антинуклеарные антитела (АНА) – гетерогенная группа аутоантител, реагирующих с различными компонентами ядра и цитоплазмы. Семейство АНА включает антитела к ДНК, гистонам, нуклеосомам, экстрагируемым ядерным антигенам (ЭЯА) (Sm, U1РНП, Ro/SSA, La/SSB, Scl-70, Jo-1), ядрышковым антигенам, центромерам и другим клеточным структурам. АНА являются основным лабораторным маркером системных аутоиммунных ревматических заболеваний (САРЗ) [1, 3, 17]. Положительные результаты определения АНА входят в число диагностических критериев системной красной волчанки (СКВ) [12, 14, 17], системной склеродермии (ССД) [10, 15], синдрома Шегрена (СШ) [2, 11], полимиозита/дерматомиозита (ПМ/ДМ) [18], смешанного заболевания соединительной ткани (СЗСТ) [16]; применяются для оценки активности, прогноза и идентификации отдельных клинико-лабораторных субтипов этих заболеваний [1, 3, 4, 8, 11, 15, 17]; служат предикторами развития САРЗ у бессимптомных пациентов [14].

Золотым стандартом и первичным скрининговым методом определения АНА в сыворотке крови является непрямая реакция иммунофлуоресценции (НРИФ) с использованием в качестве субстрата клеток линии HЕp-2 (эпителиальные клетки рака гортани человека) (НРИФ– HЕp-2) [1, 3, 13, 17, 19]. Применение стандартизованных HEp-2 клеток или варианта этой клеточной линии HEp-2000, имеющего большее количество митозов, позволяет существенно повысить чувствительность метода и достоверно описать различные типы свечения ядра. При тестировании АНА методом НРИФ их традиционно обозначают как антинуклеарный фактор (АНФ). Оценка результатов НРИФ проводится с указанием максимального конечного титра обнаружения АНФ в исследуемых сыворотках, а также интенсивности и типа иммунофлуоресценции.

Согласно международным рекомендациям, нормальные титры АНФ в сыворотке крови при использовании НРИФ-HЕp-2 составляют менее 1 : 160 [10, 17].

Указанные нормы АНФ отражают оптимальное соотношение диагностической чувствительности и специфичности метода определения АНА с помощью НРИФ-HЕp-2 и позволяют идентифицировать 95,0% больных САРЗ и 95,0% здоровых лиц. АНФ в титре 1 : 40 выявляется у 25,0–30,0%, 1 : 80 – у 10,0–15,0%, 1 : 160 и выше – у 5,0% здоровых людей. Частота обнаружения АНФ повышается с возрастом, особенно у женщин. Родственники больных аутоиммунными ревматическими заболеваниями имеют титры АНФ ≥ 1 : 40 в 25,0–30,0% случаев [17]. Характер ядерного/цитоплазматического свечения при определении АНФ методом НРИФ-HЕp-2 отражает присутствие аутоантиген-специфических АНА, ассоциирующихся с различными САРЗ (табл. 1) [3]…

При двухэтапной стратегии иммунодиагностики САРЗ пациентам с положительными результатами обнаружения АНА методом НРИФ–HEp-2 рекомендуется проведение подтверждающих тестов для выявления специфических антител к отдельным ядерным антигенам (двуспиральной (дс) ДНК, ЭЯА) с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), иммуноблота, иммунодота, двойной иммунодиффузии, контриммуноэлектрофореза, радиоиммуноанализа, иммунохемилюминисценции, иммунофлуорометрического анализа и других технологий [1, 3, 13, 17]. В то же время некоторые типы АНА (антитела к центромерам, PCNA, митотическому аппарату клетки, комплексу Гольджи) обнаруживаются только методом НРИФ-HEp-2, что исключает необходимость их дальнейшего исследования с помощью подтверждающих тестов (табл. 1). Выбор спектра подтверждающих тестов при определении аутоантиген-специфических АНА зависит от типа ядерного/цитоплазматического свечения, титров АНА в НРИФ-HЕp-2 и совокупности клинических факторов [3]. Так, при наличии у АНФ-позитивных больных клинических признаков СКВ, рекомендуется тестирование антител к дсДНК. Cтандартными методами определения антител к дсДНК в сыворотке крови служат ИФА, НРИФ с использованием в качестве субстрата Crithidia luciliae и РИА (тест Farr) [1, 3, 17].

Первичным скрининговым тестом для обнаружения антител к дсДНК является метод ИФА. С помощью ИФА определяются как низко-, так и высокоавидные IgG/IgM антитела к дсДНК, что обусловливает меньшую специфичность данного теста по сравнению с другими методами. Большое количество ложноположительных результатов при использовании ИФА может быть вызвано контаминацией дсДНК молекулами односпиральной (ос) ДНК и спонтанной денатурацией дсДНК с образованием осДНК.

Внедрение и практика применения современных методов дезинфекции и стерилизации, ресурсосберегающих технологий в деятельности сестринского персонала

17 марта 2014 года, Москва. Бизнес - завтрак для главных медицинских сестер

Подробнее

Оптимизация уборки помещений учреждений здравоохранения на основе применения современных уборочных технологий

18 марта 2014 года, Москва. Бизнес - завтрак для главных медицинских сестер

Подробнее

При положительных результатах определения антител к дсДНК методом ИФА рекомендуется проведение подтверждающих тестов (НРИФ на Crithidia luciliae и РИА Farr), обладающих меньшей чувствительностью, но более высокой специфичностью для диагностики СКВ.

В основе метода НРИФ с использованием простейшего жгутикового микроорганизма Crithidia luciliae лежит взаимодействие антител к дсДНК с кинетопластом жгутика, имеющим гигантскую митохондрию, содержащую большое количество кольцевых молекул дсДНК, не ассоциированных с гистоновыми белками. Методом НРИФ выявляются IgGи IgM-антитела к дсДНК cо средней авидностью. Тест Farr, основанный на преципитации меченной [3H]-ДНК антителами к дсДНК, позволяет измерять высокоавидные антитела к дсДНК. Некоторые разновидности антител к ЭЯА, в частности антитела к SS-A/Ro, рибосомальному белку Р и Jo-1, могут не выявляться методом НРИФ-HЕp-2. При отрицательных результатах определения антител к SS-A/Ro, рибосомальному белку Р и Jo-1 в НРИФ–HЕp-2, но высокой вероятности постановки диагноза СКВ, СШ, неонатальной волчанки, врожденной поперечной блокады сердца или ПМ/ДМ следует использовать альтернативные методы идентификации данных аутоантител (ИФА, иммуноблот и др.) [3].

Новые подходы к определению антинуклеарных антител при системных аутоиммунных ревматических заболеваниях

В последние годы в практике клинико-диагностических лабораторий широкое распространение получили скрининговые методы определения АНА при помощи ИФА и мультиплексных биоаналитических технологий с использованием планарных и суспензионных микрочипов (табл. 2) [19]. Такие диагностические платформы автоматизированы, имеют высокую производительность и позволяют одновременно исследовать профиль АНА в небольшом объеме образцов сыворотки крови пациента. Однако, по мнению экспертов EULAR (Европейской антиревматической лиги) и ACR (Американской коллегии ревматологов), новые методы моноплексного и мультиплексного иммунного анализа не могут заменить первичный скрининг АНА с использованием НРИФ-HЕp-2, т. к. идентифицируют антитела к ограниченному количеству очищенных/рекомбинантных антигенов или смеси антигенов (ядерному гомогенату) с измененными либо утраченными эпитопами, что приводит к увеличению процента ложноотрицательных результатов [3, 13]. Лаборатории, проводящие скрининговое определение АНА с использованием альтернативных методов твердофазного анализа (ИФА, мультиплексные диагностические системы), должны предоставить данные о такой же или более высокой чувствительности и специфичности этих технологий по сравнению с НРИФ-HЕp-2, а при расхождении результатов измерения АНА с клиническими данными обязательно провести повторное исследование АНА методом НРИФ-HЕp-2 [3, 13].

Следует отметить, что рутинная технология флуоресцентной микроскопии имеет ряд ограничений, к которым относятся различия используемых методик (тип микроскопа, используемые тест-системы и реагенты, время инкубации и др.), субъективизм исследователя при оценке титра и типа свечения АНФ, необходимость длительного обучения персонала, отсутствие квалифицированной экспертной оценки результатов исследования, что приводит к значительной внутриимежлабораторной вариабельности полученных данных.

Разработка автоматизированных систем интерпретации клеточных флуоресцентных тестов создает предпосылки для стандартизации и улучшения воспроизводимости НРИФ-HЕp-2 при определении АНА у больных САРЗ [7, 9, 20, 21]. Среди готовых технологических платформ, осуществляющих анализ АНА путем автоматической визуализации и объективного распознавания образцов флуоресценции, одни аналитические системы проводят только скрининг положительных и отрицательных результатов НРИФ-HЕp-2 (Helios, Aesku Diagnostics, Wendelsheim, Germany; Image Navigator, Immuno Concept, Sacramento, USA; Cytospot, Autoimmun Diagnostika, Straβberg, Germany), в то время как другие способны также классифицировать основные типы свечения клеточных структур (AKLIDES, Medipan, Dahlewitz/Berlin, Germany; Nova View Inova, San Diego, USA; Zenit G Sight, A. Menarini Diagnostics, Grassina-Firenze, Italy; Europattern, Euroimmun, Lubeck, Germany) [21].

Нами было проведено исследование АНА в сыворотке крови у 1178 больных (185 больных СКВ, 148 – СШ, 181 – ССД, 44 – ПМ/ДМ, 60 – перекрестным синдромом, 35 – антифосфолипидным синдромом, 525 – другими РЗ), наблюдавшихся в ФГБУ «НИИР им. В.А. Насоновой» РАМН в течение 2012 г.

АНА определяли методом НРИФ-НЕр-2 с помощью набора реагентов AKLIDES®ANA (Medipan GmbH, Германия) согласно инструкции фирмы-изготовителя. Обработку результатов НРИФ-HЕp-2 проводили с использованием автоматизированной платформы AKLIDES (Medipan GmbH, Германия) на основе многопараметрического анализа внутриклеточных структур и путем визуальной оценки образцов флуоресценции под микроскопом AXIOSKOP 40 (Zeiss, Германия). Для измерения степени согласованности автоматизированной и визуальной интерпретации результатов определения АНА применялся коэффициент каппа (κ) Коэна [6]. Согласованность результатов оценивалась как «слабая» (κ < 0,4), «хорошая» (0,4 < κ ≤ 0,75) и «высокая» (κ > 0,75).

Степень согласованности позитивных/негативных результатов обнаружения (κ = 0,5) типов (κ = 0,7) и титров/интенсивности свечения (κ = 0,45) АНА при автоматизированной и традиционной интерпретации НРИФ-HEp-2 являлась «хорошей». Несовпадение позитивных/негативных результатов исследования АНА, по данным автоматизированного и визуального методов оценки НРИФ-HEp-2, отмечалось у 18,5% пациентов. Автоматизированным методом наиболее часто определялось гомогенное (37,6%) и крапчатое (32,3%) свечение ядра; у 21,4% больных тип свечения не дифференцировался. Визуальным методом в сыворотках крови большинства пациентов (72,8%) выявлялся смешанный тип свечения. Смешанное свечение распознавалось системой AKLIDES как гомогенное у 40,5% больных, крапчатое – у 32,7%, нуклеолярное – у 2,4%, центромерное – у 0,9%, недифференцированное – у 23,5% больных. При визуальном исследовании образцов флуоресценции с недифференцированным типом свечения в 79,8% случаев было идентифицировано смешанное, 5,9% – гомогенное, 14,3% – крапчатое свечение. Титры АНА менее 1 : 160 ассоциировались с интенсивностью свечения «0»/«±»; 1 : 160 – «0», «±», «+», «++»; 1 : 320 – «+», «++»; 1 : 640 – «++», «+++»; ≥ 1 : 1280 – «+++», «++++».

Полученные результаты подтверждают данные литературы о хорошей согласованности автоматизированной и визуальной интерпретации НРИФ-HEp-2 при исследовании АНА в сыворотке крови больных САРЗ [7, 9, 20, 21]. Позитивные/негативные результаты определения АНФ рутинным методом и на анализаторе AKLIDES совпадали у 81,5% больных РЗ (κ = 0,5). В работах других авторов согласованность позитивных/негативных результатов выявления АНА, по данным автоматизированной и визуальной оценки НРИФ-HEp-2, достигала 90,0–99,4% (κ = 0,554–0,984) [7, 9, 20]. В целом в группе обследованных нами больных РЗ (n = 1178) чувствительность определения АНА с помощью автоматизированной платформы AKLIDES была выше, чем при использовании визуальной микроскопической техники (80,0 и 71,6%, соответственно, p < 0,05). Возможными причинами несовпадения результатов автоматизированной и визуальной идентификации позитивности/негативности ядерного свечения являются расхождения в оценке отрицательных/низких титров АНФ и интенсивности сигнала флуоресценции; учет цитоплазматического свечения системой AKLIDES; артефакты, связанные с некачественной окраской препаратов.

Одной из важных проблем автоматизированной оценки характера ядерного свечения при определении АНА методом НРИФ-HEp-2 является трудность дифференцировки гомогенного типа свечения от различных форм мелкого диффузного крапчатого свечения ядра и цитоплазмы клетки. Другим сложным аспектом автоматизированной обработки результатов клеточных флуоресцентных тестов является распознавание смешанного свечения при сочетании в одном АНФ-позитивном образце сыворотки крови больного четырех-пяти различных типов флуоресценции за счет аутоантител, реагирующих с множеством ядерных антигенов. В нашей работе автоматизированная система AKLIDES идентифицировала в основном гомогенное (37,6%) и крапчатое (32,3%) свечение, однако в 21,4% случаев регистрировала недифференцированный тип свечения, который у 79,8% больных РЗ распознавался визуальным методом как смешанный. После исключения из анализа недифференцированного и смешанного свечения, совпадение по типам флуоресценции при автоматизированной и визуальной интерпретации положительных результатов НРИФ-HEp-2 составляло 80,0% (κ = 0,7). Расхождения в интерпретации типов ядерного свечения при автоматизированной и визуальной обработке результатов НРИФ-HEp-2 могут быть связаны с комбинацией различных типов свечения в одном образце (смешанное свечение), наличием редких типов свечения (антител к ядерной мембране, комплексу Гольджи и др.), титрами АНФ. В связи с этим рекомендуется проведение дополнительного визуального исследования АНА-позитивных образцов флуоресценции для уточнения и классификации типов ядерного свечения [7, 9, 20].

Полученные результаты подтверждают данные литературы о хорошей согласованности титров АНА с интенсивностью флуоресценции, оцениваемой системой AKLIDES [7, 9].

В рутинной практике автоматизированная платформа AKLIDES и другие автоматизированные системы интерпретации клеточных флуоресцентных тестов позволяют осуществлять эффективный объективный скрининг позитивных и негативных результатов определения АНА методом НРИФHEp-2, а также прогнозировать максимальный конечный титр АНА в сыворотках крови больных САРЗ по интенсивности сигнала флуоресценции. Для подтверждения результатов автоматизированной оценки типов ядерного свечения и уточнения титров АНА рекомендуется дополнительное экспертное визуальное исследование позитивных образцов флуоресценции. 

 *Статья приведена с сокращениями

Перейти к другим публикациям

Узнать о подписке на журнал

Читайте в ближайших номерах журнала «Справочник заведующего КДЛ»
    Читать >>


    Ваша персональная подборка

      Подписка на статьи

      Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

      Рекомендации по теме

      Мероприятия

      Мероприятия

      Повышаем квалификацию

      Посмотреть

      Самое выгодное предложение

      Самое выгодное предложение

      Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

      Живое общение с редакцией

      А еще...








      Наши продукты






















      © МЦФЭР, 2006 – 2017. Все права защищены.

      Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

      Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
      Свидетельство о регистрации средства массовой информации ПИ № ФС77-64203 от 31.12.2015.

      Политика обработки персональных данных

      
      • Мы в соцсетях
      Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×